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抗根结线虫基因的克隆、遗传转化及黑籽南瓜再生体系的建立

中文摘要第1-11页
ABSTRACT第11-13页
第一章 文献综述第13-33页
 1 关于根结线虫的研究第13-17页
   ·根结线虫的分类、形态特征及形态鉴定第13-14页
   ·根结线虫的危害第14-17页
     ·现状第14页
     ·生活史第14-15页
     ·危害机理第15-17页
 2 抗线虫基因工程研究进展第17-30页
   ·抗线虫效应物第18-27页
     ·蛋白酶抑制剂第18-20页
     ·其他潜在的抗线虫效应物第20-22页
     ·自然抗性基因(R-GENE)第22-25页
     ·RNAi 对基因功能的探索和潜在的抗性第25-26页
     ·抗性基因的叠加第26-27页
   ·基因工程防治线虫的启动子研究第27-29页
     ·抗线虫效应物和组成型启动子第27-28页
     ·根特异性启动子第28页
     ·启动子的改造第28-29页
     ·线虫取食位点的启动子和细胞的减毒作用第29页
   ·生物安全性第29-30页
     ·食品安全性第29-30页
     ·环境安全性第30页
 3 关于黑籽南瓜的研究进展第30-31页
 4 现状分析第31-32页
   ·Mi 基因抗性第31页
   ·外源抗线虫基因的抗性第31页
   ·诱导型根特异性启动子抗性第31-32页
 5 立题依据第32-33页
第二章 基因克隆与载体构建第33-55页
 1 材料与方法第33-44页
   ·实验材料第33-34页
     ·植物材料第33页
     ·酶及重要试剂第33页
     ·菌株和载体第33页
     ·培养基第33页
     ·试剂配制第33-34页
   ·实验方法第34-44页
     ·启动子RKNIP 片断的克隆第34-38页
     ·OCI-ΔD86 的克隆第38-40页
     ·16D10-33 的克隆第40-41页
     ·植物表达载体的构建第41-44页
 2 结果与分析第44-53页
   ·RKNIP 启动子的克隆第44-48页
     ·烟草总DNA 提取结果第44页
     ·启动子RKNIP 的克隆第44页
     ·RKNIP 阳性质粒的PCR 检测酶切检测第44-45页
     ·测序验证与序列比对第45-46页
     ·RKNIP500 启动子预测第46-47页
     ·RKNIP300 序列分析第47-48页
   ·OCI-ΔD86 的克隆第48-49页
     ·OCI-ΔD86 的PCR 扩增结果第48页
     ·酶切验证第48-49页
     ·测序验证第49页
   ·16D10-33 的克隆第49-50页
     ·pGEM-T-RKNIP- OCIΔ86 中间载体的获得第49-50页
     ·pTT33 的获得第50页
   ·植物表达载体的构建结果第50-53页
     ·pROR 中间载体的验证第50页
     ·双元载体pRTO 的验证第50-51页
     ·双元载体pRO 的验证第51页
     ·pRT33 的的验证第51-52页
     ·pRTOT33 双价载体的验证第52-53页
 3 讨论第53-55页
   ·基因的克隆与利用第53页
   ·重叠PCR 技术的应用第53页
   ·关于酶切反应第53-54页
   ·关于连接反应第54-55页
第三章 OC-IΔD86 (ORYZACYSTATIN-IΔD86)基因的原核表达、活性分析及抗体制备第55-63页
 1 材料与方法第55-57页
   ·实验材料第55页
     ·质粒、菌株和生化试剂第55页
     ·引物设计第55页
     ·试验动物第55页
   ·ELISA 检测试剂配制第55-56页
   ·方法第56-57页
     ·PCR 反应与原核表达载体的构建第56页
     ·原核表达与纯化第56页
     ·活性分析第56页
     ·免疫注射第56-57页
     ·ELISA 检测方法第57页
 2 结果与分析第57-62页
   ·pet216-OC-I ΔD86 的鉴定第57-58页
   ·表达分析第58-59页
   ·纯化第59页
   ·活性分析第59-60页
   ·抗原稀释倍数的确定及二次免疫后ELISA 效价第60-61页
   ·三免后ELISA 效价检测第61-62页
 3 讨论第62-63页
   ·关于抗根结线虫效应物的评价及活性研究第62页
   ·关于PET 载体构建策略第62-63页
第四章 抗根结线虫植物表达载体在烟草上的遗传转化及功能研究第63-72页
 1 材料与方法第63-66页
   ·植物材料第63页
   ·农杆菌、质粒和生化试剂第63页
   ·培养基第63页
   ·方法第63-66页
     ·农杆菌感受态细胞的制备第63页
     ·质粒转入根癌农杆菌第63-64页
     ·农杆菌培养第64页
     ·侵染第64页
     ·共培养第64页
     ·选择培养第64页
     ·生根培养第64页
     ·驯化移栽第64页
     ·转化植株的分子检测第64-66页
     ·转基因植株的表型与功能分析第66页
 2 结果与分析第66-70页
   ·转基因烟草的获得第66-67页
   ·转基因烟草的分子鉴定第67-70页
     ·CTAB 提取总DNA第67页
     ·部分植株的PCR 检测第67-68页
     ·部分植株的Southern 杂交检测第68页
     ·部分植株的ELISA 检测第68-69页
     ·转基因烟草表达模式ELISA 检测第69-70页
   ·抗根结线虫表型鉴定第70页
 3 讨论第70-72页
   ·关于转基因沉默第70-71页
   ·抗线虫机理第71-72页
第五章 黑籽南瓜再生体系的建立第72-83页
 1 材料与方法第72-73页
   ·植物材料第72页
   ·植物激素与培养基第72页
   ·方法第72-73页
     ·子叶不定芽再生体系的建立第72-73页
     ·成熟胚外植体不定芽再生体系的建立第73页
 2 结果与分析第73-81页
   ·黑籽南瓜子叶不定芽再生体系的建立结果第73-80页
     ·不定芽的再生第73-74页
     ·6-BA 浓度对不定芽发生的影响第74页
     ·苗龄对不定芽发生的影响第74-75页
     ·IAA 浓度对不定芽发生的影响第75-76页
     ·细胞分裂素的种类和浓度对不定芽发生的影响第76-77页
     ·芽的伸长第77页
     ·不定芽的生根和移栽第77-80页
   ·黑籽南瓜成熟胚再生体系的建立结果第80-81页
 3 讨论第81-83页
   ·黑籽南瓜再生体系研究优化第81-83页
     ·外植体类型的选择第81页
     ·子叶外植体供体苗龄对不定芽发生的影响第81-82页
     ·生长素IAA 对子叶外植体不定芽发生的影响第82页
     ·不同的细胞分裂素对子叶外植体不定芽发生的影响第82页
     ·成熟胚外植体不定芽再生的探讨第82-83页
结论第83-84页
参考文献第84-101页
附录第101-104页
致谢第104-105页
攻读博士学位期间发表的学术论文第105页

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