| 目录 | 第1-7页 |
| 中文摘要 | 第7-9页 |
| 英文摘要 | 第9-12页 |
| 前言 | 第12-29页 |
| 1. 红系分化是个有序调控的过程 | 第12-18页 |
| ·造血生成概述 | 第12-14页 |
| ·红系的发育、分化和成熟 | 第14-15页 |
| ·红细胞生成的转录调控 | 第15-18页 |
| 2. GATA-1是红系分化过程中重要的转录因子 | 第18-24页 |
| ·GATA-1基因表达和蛋白结构特点 | 第18-19页 |
| ·GATA-1的转录活性受到多个水平的调控 | 第19-21页 |
| ·GATA-1可与多种蛋白相互作用 | 第21-22页 |
| ·GATA-1通过下游靶基因发挥重要生物学功能 | 第22-24页 |
| 3. 早幼粒细胞白血病蛋白PML及其在红系造血中的作用 | 第24-28页 |
| ·PML的结构与表达 | 第24-25页 |
| ·PML参与多种生理功能 | 第25-26页 |
| ·PML蛋白在红系造血中的作用 | 第26-27页 |
| ·PML蛋白通过参与转录调节实现其多种生理功能 | 第27-28页 |
| 4. 本研究的主要内容 | 第28-29页 |
| 材料与方法 | 第29-58页 |
| 一、实验材料 | 第29-31页 |
| 1. 菌株与质粒 | 第29页 |
| 2. 细胞系及实验用小鼠 | 第29页 |
| 3. 限制性内切酶及修饰酶 | 第29-30页 |
| 4. 抗体 | 第30页 |
| 5. 其它主要试剂和材料 | 第30页 |
| 6. 主要仪器设备 | 第30-31页 |
| 二、实验方法 | 第31-58页 |
| 1. 基本技术路线 | 第31页 |
| 2. 细菌操作与质粒的转化提取 | 第31-33页 |
| ·感受态大肠杆菌DH5a制备 | 第31-32页 |
| ·质粒的转化 | 第32页 |
| ·质粒的提取和纯化 | 第32-33页 |
| 3. 实验中所用细胞的培养 | 第33-34页 |
| ·细胞培养 | 第33页 |
| ·细胞的传代 | 第33-34页 |
| ·细胞的复苏及冻存 | 第34页 |
| 4. K562细胞的红系诱导和检测 | 第34-35页 |
| ·K562细胞向红系分化的诱导 | 第34页 |
| ·K562细胞红系分化的检测 | 第34-35页 |
| 5. 造血干细胞的分离纯化和诱导培养 | 第35-36页 |
| ·单个核细胞的分离和纯化 | 第35页 |
| ·CD34+造血祖细胞的分离与诱导培养 | 第35页 |
| ·流式检测细胞表面抗原标记物 | 第35-36页 |
| ·Wright-Giemsa染色 | 第36页 |
| 6. 克隆构建 | 第36-37页 |
| 7. 非病毒方法介导的哺乳动物细胞转染 | 第37页 |
| 8. 逆转录病毒的包装和靶细胞的感染 | 第37-39页 |
| ·PML-pMSCV逆转录病毒载体的构建 | 第37页 |
| ·PML RNAi逆转录病毒载体的构建 | 第37-38页 |
| ·逆转录病毒的包装 | 第38页 |
| ·逆转录病毒感染靶细胞 | 第38-39页 |
| 9. 逆转录病毒感染后细胞的筛选和混合克隆的获得 | 第39页 |
| ·筛选药物的配制 | 第39页 |
| ·混合克隆细胞株的获得 | 第39页 |
| 10. 定量和半定量RT-PCR | 第39-43页 |
| ·细胞总RNA的提取 | 第39-40页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第40页 |
| ·RT-PCR检测 | 第40-41页 |
| ·real-time PCR检测 | 第41-43页 |
| 11. Western-Blotting | 第43-46页 |
| ·细胞总蛋白提取 | 第43页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第43页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第43-44页 |
| ·转膜 | 第44页 |
| ·抗原抗体反应 | 第44-45页 |
| ·ECL化学发光法显色 | 第45页 |
| ·Western Blot所用的各种溶液 | 第45-46页 |
| 12. 双荧光素酶报告系统检测 | 第46-47页 |
| ·细胞的转染 | 第46页 |
| ·荧光测定 | 第46-47页 |
| 13. 蛋白质免疫共沉淀 | 第47-48页 |
| ·细胞裂解 | 第47页 |
| ·免疫共沉淀 | 第47页 |
| ·SDS-PAGE | 第47-48页 |
| 14. 蛋白质体外相互作用—GST pull down | 第48-50页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第48页 |
| ·检测融合蛋白的表达 | 第48页 |
| ·融合蛋白的大量表达 | 第48-49页 |
| ·GST融合蛋白的纯化 | 第49页 |
| ·GST融合蛋白体外相互作用 | 第49-50页 |
| 15. 免疫荧光 | 第50-51页 |
| 16. EMSA | 第51-54页 |
| ·核蛋白提取 | 第51-52页 |
| ·生物素标记探针 | 第52页 |
| ·PAGE电泳转膜 | 第52-53页 |
| ·杂交及显影 | 第53页 |
| ·溶液配制 | 第53-54页 |
| 17. 染色质免疫沉淀(ChIP)分析 | 第54-57页 |
| ·细胞固定 | 第54页 |
| ·细胞核的提取 | 第54页 |
| ·细胞核的裂解与超声处理 | 第54页 |
| ·超声结果的分析 | 第54-55页 |
| ·免疫沉淀 | 第55页 |
| ·DNA的分离及纯化 | 第55页 |
| ·PCR反应 | 第55-56页 |
| ·ChIP实验中所用的各种溶液 | 第56-57页 |
| 18. 小鼠胚胎组织的获取 | 第57-58页 |
| 实验结果 | 第58-91页 |
| 1. PML和GATA-1在红系发育和分化阶段中的表达具有一致性 | 第58-65页 |
| ·PML主要在红系发育较晚期阶段高表达 | 第58-59页 |
| ·PML在红系分化过程中持续表达 | 第59-64页 |
| ·PML在DMSO诱导MEL红系分化过程中持续表达 | 第59-60页 |
| ·PML在Estradiol诱导G1E-ER4红系成熟过程中持续表达 | 第60-61页 |
| ·PML在Hemin诱导K562红系分化过程中持续表达 | 第61-62页 |
| ·PML在EPO诱导CD34+细胞向红系分化过程中表达逐渐上升 | 第62-64页 |
| ·红系发育和分化过程中PML与红系重要转录因子GATA-1的表达趋势存在一致性 | 第64-65页 |
| 2. PML与GATA-1存在直接的相互作用 | 第65-73页 |
| ·PML4与GATA-1之间存在相互作用 | 第65-66页 |
| ·红系细胞中PML与GATA-1相互作用 | 第66-67页 |
| ·体外Pull-down实验证明PML可直接与GATA-1结合 | 第67-69页 |
| ·原核细胞中表达并纯化出PML和GATA-1蛋白 | 第67-68页 |
| ·PML与GATA-1直接相互作用 | 第68-69页 |
| ·PML与GATA-1相互作用的结构域分析 | 第69-71页 |
| ·GATA-1的C-ZF结构域对其与PML的相互作用是必需的 | 第69-70页 |
| ·PML的coiled-coil结构域介导了其与GATA-1的相互作用 | 第70-71页 |
| ·PML与GATA-1的相互作用是PML4亚型特异的 | 第71-72页 |
| ·PML可将GATA-1募集到PML核体 | 第72-73页 |
| 3. PML通过促进GATA-1与p300的协同作用增强GATA-1的转录活性 | 第73-82页 |
| ·PML增强GATA-1的转录激活能力 | 第73-76页 |
| ·PML与GATA-1的相互作用是其增强GATA-1活性的必要条件 | 第76-77页 |
| ·PML增强GATA-1在体内与DNA的结合 | 第77-79页 |
| ·PML促进了GATA-1与辅因子CBP/p300的协同作用 | 第79-82页 |
| ·PML增强p300对GATA-1转录活性的促进 | 第79-80页 |
| ·PML促进GATA-1与p300的相互作用 | 第80-81页 |
| ·PML增强p300对GATA-1的乙酰化 | 第81-82页 |
| ·PML促进CBP/p300在GATA-1结合位点的募集 | 第82页 |
| 4. PML促进红系细胞的分化成熟 | 第82-91页 |
| ·PML促进K562细胞的红系分化 | 第83-87页 |
| ·干扰素α处理上调PML及红系基因的表达 | 第83页 |
| ·过表达PML增强红系基因的表达 | 第83-85页 |
| ·干扰PML抑制红系基因的表达 | 第85-86页 |
| ·PML引起K562细胞增殖抑制 | 第86-87页 |
| ·PML促进G1E-ER4细胞红系分化成熟 | 第87-89页 |
| ·PML促进人原代红细胞中珠蛋白基因的表达 | 第89页 |
| ·PML对红系基因表达的影响是GATA-1依赖的 | 第89-91页 |
| 讨论 | 第91-100页 |
| 1. PML在红系发育分化过程中的表达模式提示PML与GATA-1存在关联性 | 第91-92页 |
| 2. PML与GATA-1的功能性相互作用 | 第92-96页 |
| ·PML与GATA-1的相互作用 | 第92-93页 |
| ·PML4是研究最为广泛的PML亚型 | 第93-94页 |
| ·PML4与GATA-1的相互作用对于其增强GATA-1的转录活性是必要的 | 第94页 |
| ·PML核体提供GATA-1及辅激活子CBP/p300动态相互作用的平台 | 第94-96页 |
| 3. PML4通过增强GATA-1活性促进红系分化 | 第96-98页 |
| ·PML4促进红系分化 | 第96-97页 |
| ·PML4对红系分化的影响是GATA-1依赖的 | 第97-98页 |
| 4. 本研究的不足与展望 | 第98-100页 |
| 小结 | 第100-101页 |
| 参考文献 | 第101-108页 |
| 非论文综述 | 第108-115页 |
| 参考文献 | 第111-115页 |
| 致谢 | 第115-116页 |
| 个人简历 | 第116-117页 |
