| 目录 | 第1-7页 |
| 图表索引 | 第7-9页 |
| 英文缩略词 | 第9-10页 |
| 中文摘要 | 第10-14页 |
| 英文摘要 | 第14-17页 |
| 前言 | 第17-19页 |
| 材料和方法 | 第19-39页 |
| 一.实验材料 | 第19-25页 |
| 1. 细胞 | 第19页 |
| 2. 组织 | 第19页 |
| 3. 动物 | 第19-20页 |
| 4. 主要试剂 | 第20-22页 |
| ·抗体 | 第20页 |
| ·常用试剂 | 第20-22页 |
| 5. 主要仪器及用品 | 第22-23页 |
| 6. 计算机分析软件 | 第23-24页 |
| 7. 主要自配试剂及配方 | 第24-25页 |
| 二.实验方法 | 第25-39页 |
| 1. 细胞培养 | 第25-26页 |
| ·人肝癌组织来源细胞原代培养 | 第25页 |
| ·hLCSLCs传代的培养 | 第25页 |
| ·hLCSLCs细胞系中肿瘤干细胞相关亚群的无血清悬浮培养 | 第25-26页 |
| ·骨髓瘤细胞及杂交瘤细胞的培养 | 第26页 |
| 2. 动物免疫,细胞融合,杂交瘤的选择培养及克隆 | 第26-27页 |
| ·动物免疫 | 第26页 |
| ·细胞融合及选择性培养 | 第26-27页 |
| 3. 流式细胞术检测标志物比例 | 第27-28页 |
| ·侧群干细胞的分离鉴定 | 第27页 |
| ·胞外抗原的流式细胞分析或分选 | 第27页 |
| ·胞内抗原的流式细胞分析或分选 | 第27-28页 |
| ·流式细胞术检测荧光双染 | 第28页 |
| 4. 细胞免疫荧光 | 第28-30页 |
| ·活细胞免疫细胞荧光 | 第28-29页 |
| ·固定细胞免疫荧光 | 第29页 |
| ·固定细胞免疫荧光双染 | 第29页 |
| ·免疫荧光共聚焦检测 | 第29-30页 |
| 5. 免疫组织化学检测 | 第30页 |
| 6. 细胞体外实验 | 第30-33页 |
| ·sphere细胞成球实验 | 第30-31页 |
| ·细胞增殖分析 | 第31页 |
| ·Transwell侵袭分析 | 第31-32页 |
| ·细胞迁移实验 | 第32页 |
| ·细胞周期、凋亡检测 | 第32-33页 |
| 7. 动物实验 | 第33-34页 |
| ·裸鼠致瘤实验 | 第33页 |
| ·自发转移 | 第33页 |
| ·抗体动物治疗实验 | 第33-34页 |
| 8. Western blotting及斑点杂交(Dot blot)实验 | 第34-36页 |
| ·细胞总蛋白的提取 | 第34页 |
| ·细胞水溶性蛋白与膜溶性蛋白的提取 | 第34页 |
| ·蛋白定量 | 第34-35页 |
| ·SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白质印迹 | 第35页 |
| ·斑点杂交(Dot blot)实验 | 第35页 |
| ·目的蛋白的检测 | 第35-36页 |
| 9. 抗体性质鉴定及纯化 | 第36页 |
| ·单克隆抗体亚类和亚型的鉴定 | 第36页 |
| ·疏水层析纯化IgM抗体 | 第36页 |
| 10. 抗原亲和纯化鉴定 | 第36-38页 |
| ·抗体亲和柱的制备 | 第36-37页 |
| ·亲和纯化 | 第37页 |
| ·质谱鉴定 | 第37-38页 |
| 11. 统计学分析 | 第38-39页 |
| 实验结果 | 第39-71页 |
| 一、人肝癌组织中肿瘤干细胞样细胞的分离培养及鉴定 | 第39-45页 |
| 1、分离肝癌组织中的肿瘤细胞进行原代培养 | 第39页 |
| 2、hLCSLCs中肝癌干细胞样细胞标志物的表达 | 第39-40页 |
| 3、hLCSLCs中SP细胞的裸鼠致瘤能力 | 第40-41页 |
| 4、含肝素的无血清悬浮成球培养hLCSLCs获得成球细胞 | 第41-42页 |
| 5、成球细胞中肝癌干细胞样细胞标志物的表达情况 | 第42-43页 |
| 6、hLCSLCs中成球细胞对裸鼠的致瘤能力 | 第43-45页 |
| 二、抗肝癌干细胞样细胞功能性抗体的研制及筛选 | 第45-57页 |
| 1、动物免疫及大容量单抗库的制备 | 第45-46页 |
| 2、免疫细胞化学鉴定肝癌单克隆抗体 | 第46页 |
| 3、免疫荧光双染筛选识别肝癌干细胞的单克隆抗体 | 第46-47页 |
| 4、CCK8增殖实验筛选功能性抗体 | 第47-48页 |
| 5、sphere成球筛选功能性抗体 | 第48-49页 |
| 6、筛选单克隆抗体的亚型测定 | 第49-51页 |
| 7、免疫荧光筛选仅仅靶向干细胞样细胞的功能性单抗 | 第51-52页 |
| 8、单抗识别干细胞的体内致瘤性鉴定 | 第52-57页 |
| ·流式检测6株抗体所识别抗原在细胞膜表面所含比例 | 第52页 |
| ·动物体内筛选仅仅靶向肿瘤干细胞的功能性单克隆抗体 | 第52-55页 |
| ·免疫荧光检测3G7~+、15D2~+移植瘤细胞来源 | 第55页 |
| ·抗体所识别的肝癌干细胞器官特异性转移 | 第55-57页 |
| 三、肝癌干细胞功能性基因的分离鉴定 | 第57-71页 |
| 1、肝癌干细胞功能性单克隆抗体的纯化 | 第57页 |
| 2、抗体阻断抗原功能基因的体内外功能实验研究 | 第57-66页 |
| ·15B7抗体对hLCSLCs增殖的抑制作用 | 第57-58页 |
| ·15B7抗体对hLCSLCs侵袭的抑制作用 | 第58-59页 |
| ·15B7抗体对hLCSLCs迁移的抑制作用 | 第59页 |
| ·15B7抗体对细胞周期及凋亡的影响 | 第59-61页 |
| ·15B7抗体所识别抗原的亚细胞结构定位 | 第61-62页 |
| ·抗体对hLCSLCs移植瘤生长及生存期的影响 | 第62-64页 |
| ·15B7单抗对hLCSLCs移植瘤体内治疗实验功能的初步研究 | 第64-66页 |
| 3、单克隆抗体识别抗原蛋白的提取条件的确定 | 第66页 |
| 4、免疫印迹法鉴定功能性抗原蛋白分子量 | 第66-67页 |
| 5、抗体偶联柱亲和纯化抗原蛋白 | 第67页 |
| 6、抗原蛋白的质谱鉴定 | 第67-71页 |
| 讨论 | 第71-81页 |
| 小结 | 第81-83页 |
| 论文综述 | 第83-102页 |
| 参考文献 | 第102-108页 |
| 致谢 | 第108-110页 |
| 附录 | 第110-111页 |
| 个人简历 | 第111-112页 |
| 基金资助情况 | 第112-113页 |
