| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-15页 |
| 第1部分 通过分泌和表面展示在减毒鳗弧菌中构建抗原导入系统 | 第15-111页 |
| 第1章 绪论 | 第16-33页 |
| ·重要海洋鱼类病原 | 第16-22页 |
| ·海水养殖及其病害 | 第16-17页 |
| ·虹彩病毒 | 第17-19页 |
| ·迟钝爱德华氏菌 | 第19页 |
| ·鳗弧菌 | 第19-22页 |
| ·疫苗 | 第22-26页 |
| ·灭活疫苗 | 第24页 |
| ·减毒活疫苗 | 第24-25页 |
| ·亚单位疫苗 | 第25页 |
| ·DNA疫苗 | 第25页 |
| ·载体疫苗 | 第25-26页 |
| ·多价疫苗 | 第26页 |
| ·革兰氏阴性细菌的蛋白分泌系统及其在疫苗开发中的应用 | 第26-28页 |
| ·Ⅰ型Sec独立型分泌途径 | 第26-27页 |
| ·基于大肠杆菌α-溶血素分泌系统的疫苗开发 | 第27-28页 |
| ·大肠杆菌α-溶血素分泌系统的分泌元件、表达调控 | 第27-28页 |
| ·溶血素分泌系统在疫苗开发中的应用 | 第28页 |
| ·微生物表面展示系统 | 第28-31页 |
| ·细菌表面展示系统 | 第29-30页 |
| ·Lpp-OmpA细菌表面展示系统 | 第30-31页 |
| ·绿色荧光蛋白 | 第31-32页 |
| ·绿色荧光蛋白的性质和结构 | 第31-32页 |
| ·本论文的主要内容和意义 | 第32-33页 |
| 第2章 大黄鱼虹彩病毒MCP蛋白的表达及纯化 | 第33-47页 |
| ·引言 | 第33页 |
| ·实验材料 | 第33-35页 |
| ·菌株与质粒 | 第33页 |
| ·药品与试剂 | 第33-34页 |
| ·PCR引物 | 第34页 |
| ·缓冲液 | 第34页 |
| ·微生物培养基 | 第34-35页 |
| ·实验方法 | 第35-42页 |
| ·细菌培养及菌种保藏 | 第35页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第35-36页 |
| ·大肠杆菌的钙转化 | 第36页 |
| ·DNA的琼脂糖凝胶电泳 | 第36页 |
| ·常规分子生物学操作 | 第36页 |
| ·PCR方法 | 第36-37页 |
| ·菌落PCR | 第37-38页 |
| ·DNA产物纯化及DNA电泳胶回收 | 第38页 |
| ·mcp基因的克隆及鉴定 | 第38-39页 |
| ·PCR克隆mcp基因 | 第38页 |
| ·PCR产物的电泳分析及回收 | 第38页 |
| ·Pyrobest PCR产物加A | 第38-39页 |
| ·T-A克隆及蓝白斑筛选 | 第39页 |
| ·重组质粒pMD19-TMCP的鉴定及外源基因的测序 | 第39页 |
| ·MCP表达质粒的构建 | 第39-40页 |
| ·重组蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第40-42页 |
| ·表达菌株的构建 | 第40页 |
| ·重组蛋白的可溶性表达 | 第40页 |
| ·重组蛋白表达情况的电泳鉴定 | 第40-41页 |
| ·MCP的分离纯化 | 第41-42页 |
| ·使用间接ELISA法确定抗体使用浓度 | 第42页 |
| ·结果与讨论 | 第42-46页 |
| ·主要衣壳蛋白的克隆和鉴定 | 第42页 |
| ·MCP重组蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第42-45页 |
| ·MCP蛋白的分离纯化 | 第45页 |
| ·多克隆抗体制备 | 第45-46页 |
| ·本章小结 | 第46-47页 |
| 第3章 MCP鳗弧菌中的分泌表达 | 第47-58页 |
| ·引言 | 第47页 |
| ·材料与方法 | 第47-53页 |
| ·实验材料 | 第47-49页 |
| ·菌株与质粒 | 第47-48页 |
| ·药品与试剂 | 第48页 |
| ·PCR引物 | 第48页 |
| ·缓冲液 | 第48页 |
| ·微生物培养基 | 第48-49页 |
| ·实验方法 | 第49-53页 |
| ·细菌培养及菌种保藏 | 第49页 |
| ·鳗弧菌电穿孔转化法感受态细胞的制备 | 第49页 |
| ·鳗弧菌的电转化 | 第49-50页 |
| ·常规分子克隆 | 第50页 |
| ·分泌质粒及分泌菌株的构建 | 第50页 |
| ·融合蛋白的分泌表达 | 第50-51页 |
| ·融合蛋白分泌表达的Western-blot检测 | 第51-52页 |
| ·融合蛋白分泌表达的ELISA检测 | 第52-53页 |
| ·结果与讨论 | 第53-57页 |
| ·分泌质粒及分泌菌株的构建 | 第53页 |
| ·融合蛋白分泌表达的Western blot检测 | 第53-56页 |
| ·融合蛋白分泌表达的ELISA检测 | 第56-57页 |
| ·本章小结 | 第57-58页 |
| 第4章 基于鳗弧菌外膜蛋白锚定元件的表面展示系统的表达载体构建 | 第58-68页 |
| ·引言 | 第58页 |
| ·材料与方法 | 第58-59页 |
| ·实验材料 | 第58页 |
| ·菌株与质粒 | 第58页 |
| ·药品与试剂 | 第58页 |
| ·PCR引物 | 第58页 |
| ·实验方法 | 第58-59页 |
| ·常规分子克隆 | 第58-59页 |
| ·鳗弧菌外膜蛋白展示系统的构建 | 第59页 |
| ·结果与讨论 | 第59-67页 |
| ·各外膜蛋白定位元件活性区域的选定 | 第59-61页 |
| ·鳗弧菌外膜锚定元件的克隆鉴定及展示系统的构建 | 第61-67页 |
| ·本章小结 | 第67-68页 |
| 第5章 GFP在大肠杆菌中的表达和展示 | 第68-85页 |
| ·引言 | 第68页 |
| ·材料与方法 | 第68-72页 |
| ·实验材料 | 第68-70页 |
| ·菌株和质粒 | 第68页 |
| ·药品与试剂 | 第68-69页 |
| ·PCR引物 | 第69页 |
| ·缓冲液 | 第69-70页 |
| ·实验方法 | 第70-72页 |
| ·常规分子克隆 | 第70页 |
| ·阴性及阳性对照质粒和菌株的构建 | 第70页 |
| ·细胞密度测定 | 第70-71页 |
| ·重组蛋白的表达 | 第71页 |
| ·细菌外膜蛋白的分离 | 第71页 |
| ·使用间接ELISA法测定GFP蛋白的展示 | 第71页 |
| ·使用Western-blot法测定GFP蛋白的展示 | 第71页 |
| ·用蛋白酶可达到性实验测定GFP蛋白的展示 | 第71-72页 |
| ·结果与讨论 | 第72-83页 |
| ·GFP报告菌株及对照菌株的构建 | 第72-74页 |
| ·报告菌株外膜蛋白的分离 | 第74-75页 |
| ·GFP融合蛋白展示表达的ELISA检测 | 第75-77页 |
| ·GFP融合蛋白展示表达的Western-blot检测 | 第77-78页 |
| ·GFP融合蛋白展示表达的蛋白酶可达到性检测 | 第78页 |
| ·诱导温度对细胞生长及GFP展示的影响 | 第78-81页 |
| ·进一步考察L-U-G、W-orfl-G展示系统展示外源蛋白随时间的变化 | 第81-83页 |
| ·本章小结 | 第83-85页 |
| 第6章 在鳗弧菌中表达和展示外源蛋白EseB和MCP | 第85-103页 |
| ·引言 | 第85页 |
| ·材料与方法 | 第85-91页 |
| ·实验材料 | 第85-86页 |
| ·菌株和质粒 | 第85页 |
| ·药品与试剂 | 第85页 |
| ·PCR引物 | 第85页 |
| ·微生物培养基 | 第85-86页 |
| ·缓冲液 | 第86页 |
| ·实验方法 | 第86-91页 |
| ·细菌培养及菌种保藏 | 第86页 |
| ·常规分子克隆以及鳗弧菌的感受态细胞制备和电转化 | 第86-87页 |
| ·展示外源蛋白EseB和MCP的展示质粒及菌株的构建 | 第87-89页 |
| ·鳗弧菌展示菌株的表达 | 第89页 |
| ·细菌外膜蛋白的分离 | 第89页 |
| ·使用间接ELISA法确定抗体使用浓度和包被物浓度 | 第89-90页 |
| ·蛋白测定 | 第90页 |
| ·使用蛋白酶可达到性实验检测外源蛋白的表达 | 第90页 |
| ·使用流式细胞法检测外源蛋白的展示 | 第90-91页 |
| ·结果与讨论 | 第91-102页 |
| ·外源蛋白EseB基因的克隆及及相关展示质粒和菌株的构建 | 第91-93页 |
| ·重组表达EseB蛋白的鳗弧菌展示菌株的培养及外膜蛋白的提取 | 第93-94页 |
| ·ELISA检测各组分中的EseB融合蛋白 | 第94-95页 |
| ·Western-blot检测各组分中的EseB融合蛋白 | 第95-96页 |
| ·流式细胞法检测EseB蛋白的展示 | 第96-97页 |
| ·外源蛋白MCP的克隆及相关展示质粒和菌株的构建 | 第97-99页 |
| ·Western-blot检测各组分中的MCP融合蛋白 | 第99-101页 |
| ·MCP融合蛋白展示表达的蛋白酶可达到性检测 | 第101-102页 |
| ·本章小结 | 第102-103页 |
| 第7章 在模式动物斑马鱼中评价鳗弧菌载体疫苗的效果 | 第103-111页 |
| ·引言 | 第103页 |
| ·材料与方法 | 第103-105页 |
| ·实验材料 | 第103-104页 |
| ·菌株、质粒和培养基 | 第103页 |
| ·微生物培养基 | 第103页 |
| ·实验动物 | 第103-104页 |
| ·实验方法 | 第104-105页 |
| ·细菌培养及菌种保藏 | 第104页 |
| ·细菌对斑马鱼的注射 | 第104页 |
| ·疫苗株对斑马鱼免疫效果的测定 | 第104-105页 |
| ·结果与讨论 | 第105-110页 |
| ·野生株对斑马鱼的半致死剂量(LD50) | 第105页 |
| ·载体疫苗候选株AV/pW-26La-B免疫斑马鱼后对野生株MVM425的保护效力 | 第105-107页 |
| ·载体疫苗候选株免疫斑马鱼后对野生株EH202的保护效力 | 第107-110页 |
| ·本章小结 | 第110-111页 |
| 第2部分 鳗弧菌减毒活疫苗的优化 | 第111-152页 |
| 第8章 绪论 | 第112-115页 |
| ·新型疫苗载体系统 | 第112-115页 |
| ·与asd相关的平衡-致死宿主载体系统 | 第112-114页 |
| ·减毒细菌DNA疫苗导入系统 | 第114-115页 |
| 第9章 鳗弧菌平衡-致死宿主载体系统相关基因的克隆和鉴定 | 第115-133页 |
| ·引言 | 第115页 |
| ·实验材料 | 第115-117页 |
| ·菌株与质粒 | 第115页 |
| ·药品与试剂 | 第115页 |
| ·PCR引物 | 第115页 |
| ·缓冲液 | 第115页 |
| ·微生物培养基 | 第115-117页 |
| ·实验方法 | 第117-123页 |
| ·细菌培养及菌种保藏 | 第117-118页 |
| ·大肠杆菌的电转化 | 第118-119页 |
| ·常规分子生物学操作 | 第119页 |
| ·DNA产物纯化及DNA电泳胶回收 | 第119-120页 |
| ·asd、relA基因的克隆 | 第120页 |
| ·relA基因的克隆 | 第120页 |
| ·asd基因的克隆 | 第120页 |
| ·染色体基因框内缺失株的构建 | 第120-122页 |
| ·LacI的表达 | 第122页 |
| ·asdA、asdB回补质粒的构建 | 第122-123页 |
| ·基因序列及登录号 | 第123页 |
| ·结果与讨论 | 第123-131页 |
| ·relA、asdA、asdB基因的克隆与测序 | 第123-124页 |
| ·筛选和鉴定asdA、asdB、relA框内缺失突变株 | 第124-127页 |
| ·△relA2::araC PBAD lacI TT突变株中LacI表达的Western blot验证 | 第127-128页 |
| ·asdA、asdB的互补实验 | 第128-131页 |
| ·本章小结 | 第131-133页 |
| 第10章 asdA、asdB基因的结构和序列分析 | 第133-137页 |
| ·引言 | 第133页 |
| ·材料与方法 | 第133页 |
| ·结果与讨论 | 第133-136页 |
| ·AsdA、AsdB序列分析 | 第133-135页 |
| ·AsdA、AsdB的3D结构分析 | 第135-136页 |
| ·本章小结 | 第136-137页 |
| 第11章 鳗弧菌GAPDH的克隆、表达和定位分析 | 第137-146页 |
| ·引言 | 第137页 |
| ·材料与方法 | 第137-138页 |
| ·菌株、质粒和试剂 | 第137-138页 |
| ·PCR引物 | 第138页 |
| ·实验方法 | 第138-140页 |
| ·常规分子克隆 | 第138页 |
| ·gap基因的克隆与鉴定 | 第138页 |
| ·GAPDH表达质粒的构建 | 第138-139页 |
| ·重组蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第139-140页 |
| ·细菌各组分蛋白的分离 | 第140页 |
| ·鳗弧菌GAPDH蛋白及其抗体的检测 | 第140页 |
| ·结果与讨论 | 第140-145页 |
| ·gap的克隆与鉴定 | 第140-141页 |
| ·GAPDH重组蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第141-143页 |
| ·GAPDH蛋白的分离纯化 | 第143页 |
| ·多克隆抗体制备 | 第143页 |
| ·GAPDH在鳗弧菌各组分中的定位 | 第143-145页 |
| ·本章小结 | 第145-146页 |
| 第12章 总结与展望 | 第146-152页 |
| ·全文总结 | 第146-148页 |
| ·本文创新点 | 第148-149页 |
| ·展望 | 第149-152页 |
| 参考文献 | 第152-162页 |
| 攻读博士学位期间发表的研究论文 | 第162-163页 |
| 致谢 | 第163-164页 |
