| 致谢 | 第5-6页 |
| 序言 | 第6-8页 |
| 中文摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 英文缩写词表 | 第13-21页 |
| 第1章 引言 | 第21-28页 |
| 1.1 钩端螺旋体 | 第21页 |
| 1.2 钩端螺旋体病 | 第21-22页 |
| 1.3 人血管性假血友病因子 | 第22-23页 |
| 1.4 研究内容及目的 | 第23-26页 |
| 1.4.1 研究内容 | 第23-26页 |
| 1.5 研究路线 | 第26-27页 |
| 1.6 本论文创新之处 | 第27-28页 |
| 第2章 问号钩端螺旋体vwa基因的克隆与表达 | 第28-54页 |
| 2.1 材料 | 第28-33页 |
| 2.1.1 实验菌株 | 第28页 |
| 2.1.2 实验质粒 | 第28页 |
| 2.1.3 实验动物 | 第28页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第28-29页 |
| 2.1.5 主要试剂 | 第29-31页 |
| 2.1.6 主要试剂配制 | 第31-33页 |
| 2.2 方法 | 第33-46页 |
| 2.2.1 问号钩体vwa基因产物功能结构域的分析 | 第33页 |
| 2.2.2 问号钩体vwa序列生物信息学分析 | 第33页 |
| 2.2.3 问号钩体的培养 | 第33页 |
| 2.2.4 问号钩体基因组DNA的提取 | 第33-34页 |
| 2.2.5 目的基因的扩增及扩增产物的纯化 | 第34-36页 |
| 2.2.6 T-A克隆 | 第36-38页 |
| 2.2.7 vwa-Ⅰ528和vwa-Ⅱ603基因原核表达系统的构建及重组蛋白的提纯 | 第38-45页 |
| 2.2.8 rL-vWA-Ⅰ及rL-vWA-Ⅱ蛋白LPS的去除及测定 | 第45-46页 |
| 2.3 结果 | 第46-53页 |
| 2.3.1 问号钩体vwa-Ⅰ和vwa-Ⅱ基因产物均含有vWF-A超家族功能域 | 第46-47页 |
| 2.3.2 问号钩体vwa-Ⅰ528和vwa-Ⅱ603基因产物序列均无跨膜区 | 第47-48页 |
| 2.3.3 问号钩体vwa-Ⅰ528或vwa-Ⅱ603基因产物序列均无信号肽 | 第48-49页 |
| 2.3.4 问号钩体vwa-Ⅰ528或vwa-Ⅱ603基因产物结构与人vWF-A相似 | 第49-50页 |
| 2.3.5 问号钩体vwa-Ⅰ528和vwa-Ⅱ603基因的PCR扩增 | 第50-51页 |
| 2.3.6 T-A克隆鉴定 | 第51页 |
| 2.3.7 亚克隆鉴定 | 第51-52页 |
| 2.3.8 rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ的表达提纯 | 第52-53页 |
| 2.3.9 rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ中无LPS污染 | 第53页 |
| 2.4 小结 | 第53-54页 |
| 第3章 钩体vwa基因产物与人血小板和GPIbα的结合能力 | 第54-67页 |
| 3.1 材料 | 第54-55页 |
| 3.1.1 主要仪器 | 第54页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第54-55页 |
| 3.1.3 主要试剂的配制 | 第55页 |
| 3.2 方法 | 第55-59页 |
| 3.2.1 PCR检测钩体vwa基因在不同血清群血清型钩体中的分布 | 第55-56页 |
| 3.2.2 rLep-vWA-Ⅰ及rLep-vWA-Ⅱ圆二色谱(CD)分析 | 第56页 |
| 3.2.3 血小板的制备 | 第56页 |
| 3.2.4 rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ与血小板的结合 | 第56-57页 |
| 3.2.5 rLep-vWA-ⅠrLep-vWA-Ⅱ抗体封闭试验 | 第57页 |
| 3.2.6 人血小板rHu-GPIbα抗体封闭试验 | 第57页 |
| 3.2.7 SPR检测rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ与rHu-GPIbα的结合 | 第57页 |
| 3.2.8 ITC检测rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ与rHu-GPIbα的结合 | 第57-58页 |
| 3.2.9 共沉淀试验 | 第58页 |
| 3.2.10 鉴定rHu-GPIbα结合的钩体蛋白 | 第58页 |
| 3.2.11 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第58页 |
| 3.2.12 银染 | 第58-59页 |
| 3.2.13 统计学分析 | 第59页 |
| 3.3 结果 | 第59-65页 |
| 3.3.1 钩体vwa基因在不同血清群血清型钩体中的广泛分布 | 第59-60页 |
| 3.3.2 rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ的圆二色谱扫描结构 | 第60页 |
| 3.3.3 rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ与血小板的强结合能力 | 第60-63页 |
| 3.3.4 SPR检测rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ与rHu-GPIbα的强结合能力 | 第63-64页 |
| 3.3.5 ITC检测rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ与rHu-GPIbα的强结合能力 | 第64页 |
| 3.3.6 rHu-GPIbα在钩体全蛋白中捕获Lep-vWA-Ⅰ和Lep-vWA-Ⅱ | 第64-65页 |
| 3.3.7 rHu-GPIbα捕获钩体全蛋白中Lep-vWA-Ⅰ和Lep-vWA-Ⅱ的质谱鉴定 | 第65页 |
| 3.4 小结 | 第65-67页 |
| 第4章 钩体vwa基因产物抑制血小板聚集及信号通路的检测 | 第67-82页 |
| 4.1 材料 | 第67-69页 |
| 4.1.1 主要仪器 | 第67页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第67-68页 |
| 4.1.3 主要试剂的配制 | 第68-69页 |
| 4.2 方法 | 第69-73页 |
| 4.2.1 人外周血中血小板的分离 | 第69页 |
| 4.2.2 rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ对体外血小板聚集的作用 | 第69页 |
| 4.2.3 rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ抗体封闭试验 | 第69页 |
| 4.2.4 Western blot检测血小板信号通路激酶的表达及磷酸化水平 | 第69-70页 |
| 4.2.5 血小板NO的定量测定 | 第70-71页 |
| 4.2.6 血小板cGMP的定量测定 | 第71页 |
| 4.2.7 血小板TXA2的定量测定 | 第71-72页 |
| 4.2.8 血小板ADP的定量测定 | 第72页 |
| 4.2.9 血小板Ca~(2+)的定量测定 | 第72-73页 |
| 4.2.10 统计学分析 | 第73页 |
| 4.3 结果 | 第73-81页 |
| 4.3.1 rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ抑制vWF/ristocetin诱导血小板聚集 | 第73-74页 |
| 4.3.2 rLep-vWA-IgGs阻断rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ抑制血小板聚集 | 第74-75页 |
| 4.3.3 rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ作用血小板后激酶磷酸化修饰水平无变化 | 第75-76页 |
| 4.3.4 rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ作用血小板后NO水平无升高 | 第76-78页 |
| 4.3.5 rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ作用血小板后cGMP水平无升高 | 第78页 |
| 4.3.6 rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ作用血小板后TXA2水平无升高 | 第78-79页 |
| 4.3.7 rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ作用血小板后ADP水平无升高 | 第79-80页 |
| 4.3.8 rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ作用血小板后Ca~(2+)水平无升高 | 第80-81页 |
| 4.4 小结 | 第81-82页 |
| 第5章 钩端螺旋体vwa基因产物突变体的功能 | 第82-101页 |
| 5.1 材料 | 第82-85页 |
| 5.1.1 实验菌株 | 第82页 |
| 5.1.2 实验质粒 | 第82页 |
| 5.1.3 主要仪器 | 第82-83页 |
| 5.1.4 主要试剂 | 第83-84页 |
| 5.1.5 主要试剂配制 | 第84-85页 |
| 5.2 方法 | 第85-86页 |
| 5.2.1 钩体vwa-Ⅰ528和vwa-Ⅱ603基因的定点突变 | 第85页 |
| 5.2.2 钩体vwa-Ⅰ528和vwa-Ⅱ603基因突变体PCR鉴定 | 第85页 |
| 5.2.3 钩体vwa-Ⅰ528和vwa-Ⅱ603基因突变体的表达及提纯 | 第85页 |
| 5.2.4 rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ突变蛋白LPS的去除及测定 | 第85页 |
| 5.2.5 rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ突变蛋白血小板聚集试验 | 第85页 |
| 5.2.6 rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ突变蛋白与血小板的结合 | 第85页 |
| 5.2.7 SPR检测rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ突变蛋白与rHu-GPIbα的结合 | 第85页 |
| 5.2.8 ITC检测rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ突变蛋白与rHu-GPIbα的结合 | 第85-86页 |
| 5.2.9 统计学分析 | 第86页 |
| 5.3 结果 | 第86-99页 |
| 5.3.1 钩体vwa-Ⅰ528和vwa-Ⅱ603突变体基因的PCR扩增 | 第86页 |
| 5.3.2 钩体vwa-Ⅰ528和vwa-Ⅱ603突变体重组产物的表达提纯 | 第86-87页 |
| 5.3.3 钩体vwa-Ⅰ528和vwa-Ⅱ603突变体蛋白无LPS污染 | 第87-88页 |
| 5.3.4 rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ突变蛋白对抑制血小板聚集能力的减弱 | 第88-92页 |
| 5.3.5 rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ突变蛋白与血小板结合能力的减弱 | 第92-95页 |
| 5.3.6 SPR检测rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ突变蛋白与rHu-GPIbα结合能力的减弱 | 第95-97页 |
| 5.3.7 ITC检测rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ突变蛋白与rHu-GPIbα结合能力的减弱 | 第97-99页 |
| 5.4 小结 | 第99-101页 |
| 第6章 钩体感染HUVEC后vwa基因表达及其外分泌情况 | 第101-115页 |
| 6.1 材料 | 第101-103页 |
| 6.1.1 实验菌株 | 第101页 |
| 6.1.2 实验细胞 | 第101页 |
| 6.1.3 主要仪器 | 第101页 |
| 6.1.4 主要试剂 | 第101-103页 |
| 6.1.5 主要试剂配制 | 第103页 |
| 6.2 方法 | 第103-108页 |
| 6.2.1 HUVEC的培养 | 第103页 |
| 6.2.2 钩体的计数 | 第103-104页 |
| 6.2.3 RT-PCR引物 | 第104页 |
| 6.2.4 钩体感染HUVEC前后vwa基因mRNA表达水平变化 | 第104-105页 |
| 6.2.5 问号钩体总RNA的提取 | 第105页 |
| 6.2.6 RNA的定量 | 第105页 |
| 6.2.7 反转录反应 | 第105-106页 |
| 6.2.8 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) | 第106-107页 |
| 6.2.9 钩体胞内总蛋白的提取 | 第107页 |
| 6.2.10 钩体L-vWA-Ⅰ和L-vWA-Ⅱ的分泌性检测 | 第107-108页 |
| 6.2.11 钩体L-vWA-Ⅰ和L-vWA-Ⅱ分泌的抑制试验 | 第108页 |
| 6.2.12 Western blot | 第108页 |
| 6.2.13 Western blot条带灰度值的分析 | 第108页 |
| 6.2.14 统计学分析 | 第108页 |
| 6.3 结果 | 第108-114页 |
| 6.3.1 钩体感染HUVEC后vwa-Ⅰ和vwa-ⅡmRNA水平的升高 | 第108-109页 |
| 6.3.2 钩体感染HUVEC后胞内Lep-vWA-Ⅰ和Lep-vWA-Ⅱ表达水平的升高 | 第109-111页 |
| 6.3.3 钩体感染HUVEC后Lep-vWA-Ⅰ和Lep-vWA-Ⅱ可以外分泌 | 第111-112页 |
| 6.3.4 分泌系统抑制剂对L-vWA-Ⅰ和L-vWA-Ⅱ分泌的影响 | 第112-114页 |
| 6.4 小结 | 第114-115页 |
| 第7章 问号钩体vwa基因产物诱导动物体内出血 | 第115-119页 |
| 7.1 材料 | 第115页 |
| 7.1.1 实验动物 | 第115页 |
| 7.1.2 主要仪器 | 第115页 |
| 7.1.3 主要试剂 | 第115页 |
| 7.1.4 主要试剂的配制 | 第115页 |
| 7.2 方法 | 第115-116页 |
| 7.2.1 rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ中LPS的去除及测定 | 第115页 |
| 7.2.2 rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ诱导动物体内出血及出凝血参数的测定 | 第115-116页 |
| 7.2.3 统计学分析 | 第116页 |
| 7.3 结果 | 第116-118页 |
| 7.3.1 rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ诱导小鼠体内出血 | 第116-117页 |
| 7.3.2 rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ注射小鼠后外周血出凝血时间的延长 | 第117-118页 |
| 7.4 小结 | 第118-119页 |
| 第8章 讨论与总结 | 第119-121页 |
| 第9章 人vWF的结构与功能(综述) | 第121-129页 |
| 参考文献 | 第129-144页 |
| 附录 | 第144-185页 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 | 第185-186页 |
