| 第一部分 顺铂激活肿瘤相关成纤维细胞通过旁分泌PAI-1促进食管鳞癌增殖和引起化疗耐药 Part 1 Cisplatin-activated PAI-1 secretion from cancer-associated fibroblasts promotesesophageal squamous cell carcinoma grwoth and causes chemoresistance via paracrineeffects | 第11-71页 |
| 中英文缩略词 | 第12-13页 |
| 摘要 | 第13-15页 |
| Abstract | 第15-17页 |
| 前言 | 第17-22页 |
| 一、食管癌流行病学现状及治疗进展 | 第17页 |
| 二、肿瘤微环境在食管癌中发挥的作用 | 第17-19页 |
| 三、纤溶酶原激活物抑制剂-1 (PAI-1)在食管鳞癌中的作用 | 第19-20页 |
| 四、活性氧簇(ROS)在食管鳞癌中的作用 | 第20-22页 |
| 实验材料 | 第22-26页 |
| 一、实验试剂 | 第22-24页 |
| 二、主要仪器设备 | 第24-25页 |
| 三、溶液配制 | 第25-26页 |
| 实验方法 | 第26-48页 |
| 一、细胞培养 | 第26-28页 |
| 1、细胞培养 | 第26页 |
| 2、原代培养CAF细胞 | 第26-27页 |
| 3、细胞复苏 | 第27页 |
| 4、细胞培养和传代 | 第27-28页 |
| 5、细胞的冻存 | 第28页 |
| 二、CAF的免疫荧光鉴定 | 第28-29页 |
| 三、CAF条件培养基的制备 | 第29页 |
| 四、蛋白芯片 | 第29-31页 |
| 1、实验材料及试剂 | 第29-30页 |
| 2、实验步骤 | 第30页 |
| 3、实验注意事项 | 第30-31页 |
| 五、ELISA | 第31-32页 |
| 1、实验原理 | 第31页 |
| 2、实验步骤 | 第31-32页 |
| 六、细胞共培养 | 第32-34页 |
| 1、CAF条件培养基与食管鳞癌细胞共培养 | 第32-33页 |
| 2、建立Tranwell小室共培养体系(食管鳞癌细胞与CAF) | 第33-34页 |
| 七、PAI-1对食管鳞癌细胞克隆形成的影响 | 第34页 |
| 1、实验原理 | 第34页 |
| 2、实验步骤 | 第34页 |
| 八、细胞凋亡检测 | 第34-35页 |
| 1、实验原理 | 第35页 |
| 2、实验步骤 | 第35页 |
| 九、质粒构建和转染 | 第35-38页 |
| 1、构建PAI-1过表达质粒 | 第35-36页 |
| 2、质粒的小量提取 | 第36-37页 |
| 3、质粒的中量提取 | 第37-38页 |
| 十、慢病毒的包装 | 第38-39页 |
| 1、慢病毒的包装 | 第38-39页 |
| 2、慢病毒感染目的细胞系 | 第39页 |
| 十一、细胞内ROS水平 | 第39-40页 |
| 1、实验原理 | 第39页 |
| 2、实验步骤 | 第39-40页 |
| 十二、Western blot检测蛋白表达水平 | 第40-44页 |
| 1、提取总蛋白 | 第40页 |
| 2、测定蛋白浓度 | 第40-42页 |
| 3、Western blot蛋白印迹检测蛋白表达水平 | 第42-44页 |
| 十三、体内裸鼠实验 | 第44-46页 |
| 1、裸鼠皮下成瘤实验 | 第44-45页 |
| 2、移植瘤组织蜡块的制备 | 第45-46页 |
| 3、组织切片 | 第46页 |
| 4、石蜡切片的Hematoxylin-Eosin (HE)染色 | 第46页 |
| 十四、统计方法 | 第46-48页 |
| 实验结果 | 第48-59页 |
| 一、食管鳞癌CAF的分离、培养和鉴定 | 第48页 |
| 二、顺铂预处理的CAF可以在体外促进食管鳞癌细胞的增殖和引起化疗耐药 | 第48-50页 |
| 1、使用CAF的条件培养基与食管鳞癌细胞共培养 | 第48-49页 |
| 2、使用Transwell共培养体系 | 第49-50页 |
| 三、PAI-1是顺铂处理CAF后分泌的关键细胞因子 | 第50-51页 |
| 1、蛋白芯片筛选顺铂处理CAF与未处理CAF分泌的差异细胞因子 | 第50页 |
| 2、ELISA验证蛋白芯片结果 | 第50-51页 |
| 3、顺铂处理CAF引起的改变 | 第51页 |
| 四、旁分泌的PAI-1促进食管鳞癌细胞增殖和克隆形成,同时抑制顺铂引起的食管鳞癌细胞凋亡 | 第51-53页 |
| 1、PAI-1促进食管鳞癌细胞克隆形成 | 第51-52页 |
| 2、PAI-1促进食管鳞癌细胞增殖 | 第52页 |
| 3、PAI-1抑制顺铂引起的食管鳞癌细胞凋亡 | 第52-53页 |
| 五、PAI-1抑制顺铂引起的食管鳞癌细胞ROS升高 | 第53-55页 |
| 1、顺铂引起食管鳞癌细胞ROS升高 | 第53-54页 |
| 2、PAI-1可以抑制顺铂引起的食管鳞癌细胞ROS升高 | 第54-55页 |
| 六、PAI-1可以抑制Caspase-3和γH2AX,激活AKT和ERK1/2 | 第55-57页 |
| 1、PAI-1可以抑制Caspase-3和γH2AX | 第55页 |
| 2、PAI-1可以激活ERK1/2和AKT | 第55-56页 |
| 3、PAI-1抑制剂Tiplaxtinin可以抑制AKT和ERK1/2的磷酸化水平 | 第56-57页 |
| 七、PAI-1在裸鼠体内促进食管鳞癌生长并减弱顺铂对食管鳞癌的抑瘤作用 | 第57-59页 |
| 1、PAI-1可以促进食管鳞癌细胞KYSE30在裸鼠皮下成瘤 | 第57页 |
| 2、PAI-1可以在裸鼠体内减弱顺铂的抑瘤作用 | 第57-58页 |
| 3、PAI-1抑制剂Tiplaxtinin可以协同顺铂发挥抗肿瘤作用 | 第58-59页 |
| 讨论 | 第59-64页 |
| 小结 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-71页 |
| 第二部分 长管香茶菜甲素通过增加ROS和激活JNK/p38 MAPK诱导食管鳞癌细胞凋亡 Part 2 The therapeutic effects of Longikaurin A, a natural ent-kauranoid, in esophageal squamouscell carcinoma depend on ROS accumulation and JNK/p38 MAPK activation | 第71-114页 |
| 中英文缩略词表 | 第72-73页 |
| 摘要 | 第73-75页 |
| Abstract | 第75-77页 |
| 前言 | 第77-79页 |
| 实验材料 | 第79-82页 |
| 一、实验试剂 | 第79-81页 |
| 二、主要仪器设备 | 第81-82页 |
| 实验方法 | 第82-94页 |
| 一、长管香茶菜甲素的制备与结构鉴定 | 第82页 |
| 1、LK-A的制备 | 第82页 |
| 2、LK-A的结构鉴定 | 第82页 |
| 二、细胞培养 | 第82-84页 |
| 1、实验使用的细胞系 | 第82-83页 |
| 2、细胞复苏 | 第83页 |
| 3、细胞培养和传代 | 第83-84页 |
| 4、细胞冻存 | 第84页 |
| 三、LK-A对食管鳞癌细胞增殖的影响 | 第84-85页 |
| 四、LK-A对食管鳞癌细胞克隆形成的影响 | 第85页 |
| 五、LK-A对食管鳞癌细胞周期的影响 | 第85-86页 |
| 六、LK-A对食管鳞癌细胞凋亡的影响 | 第86-88页 |
| 七、LK-A对食管鳞癌细胞ROS的影响 | 第88页 |
| 八、Western blot检测蛋白的表达水平 | 第88-90页 |
| 1、提取总蛋白 | 第88-89页 |
| 2、Western blot蛋白印迹检测蛋白表达水平 | 第89-90页 |
| 九、裸鼠实验 | 第90-93页 |
| 1、裸鼠皮下成瘤实验 | 第90-91页 |
| 2、移植瘤、肝、肾组织石蜡包埋 | 第91-92页 |
| 3、组织切片 | 第92页 |
| 4、石蜡切片的Hematoxylin-Eosin(HE)染色 | 第92-93页 |
| 十、统计方法 | 第93-94页 |
| 实验结果 | 第94-108页 |
| 一、长管香茶菜甲素的结构鉴定和纯化分析 | 第94-97页 |
| 二、LK-A选择性抑制食管鳞癌细胞的增殖和克隆形成 | 第97-98页 |
| 1、LK-A抑制食管鳞癌细胞增殖 | 第97页 |
| 2、LK-A抑制食管鳞癌细胞克隆形成 | 第97-98页 |
| 三、LK-A引起食管鳞癌细胞G2/M期阻滞 | 第98-99页 |
| 1、LK-A引起食管鳞癌细胞G2/M期阻滞 | 第98-99页 |
| 2、Western blot结果显示LK-A可以降低细胞周期相关蛋白表达水平 | 第99页 |
| 四、LK-A诱导食管鳞癌细胞凋亡 | 第99-102页 |
| 1、LK-A可以诱导食管鳞癌细胞凋亡,并呈时间、剂量依赖性 | 第99-101页 |
| 2、LK-A通过Caspase依赖的线粒体凋亡途径诱导食管鳞癌细胞凋亡 | 第101页 |
| 3、Caspase抑制剂Z-VAD(OMe)-FMK可以部分逆转LK-A引起的食管鳞癌细胞凋亡 | 第101-102页 |
| 五、ROS在LK-A诱导的食管鳞癌细胞凋亡中的作用 | 第102-103页 |
| 1、LK-A可以引起食管鳞癌细胞内ROS增加 | 第102-103页 |
| 2、NAC可以逆转LK-A引起的食管鳞癌细胞凋亡 | 第103页 |
| 六、LK-A激活MAPK通路 | 第103-105页 |
| 1、LK-A可以激活JNK和p38通路而不是Erk1/2通路。 | 第103-104页 |
| 2、JNK和p38通路抑制剂可以抑制LK-A诱导的细胞凋亡 | 第104-105页 |
| 3、NAC可以减弱JNK和p38磷酸化水平 | 第105页 |
| 七、LK-A抑制裸鼠移植瘤的生长,并具有一定的安全性 | 第105-108页 |
| 1、LK-A抑制裸鼠移植瘤的生长 | 第106页 |
| 2、评估LK-A体内的安全性 | 第106-108页 |
| 讨论 | 第108-111页 |
| 小结 | 第111-112页 |
| 参考文献 | 第112-114页 |
| 基金资助 | 第114-115页 |
| 在学期间发表论文 | 第115-116页 |
| 文献综述 | 第116-122页 |
| 参考文献 | 第119-122页 |
| 致谢 | 第122-123页 |
| 个人简历 | 第123-124页 |
