| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 符号说明 | 第13-14页 |
| 前言 | 第14-21页 |
| 1 立题依据 | 第14-18页 |
| 1.1 甘草药材用途广泛、需求巨大 | 第14页 |
| 1.2 毛状根在药用植物次生代谢研究方面具有重要价值 | 第14-15页 |
| 1.3 甘草苷是甘草的指标成分之一,具有重要的研究价值 | 第15页 |
| 1.4 功能基因是药用植物指标成分生物合成的重要分子基础 | 第15页 |
| 1.5 CHS及CHI基因是黄酮类化合物生物合成途径的重要功能基因 | 第15-18页 |
| 2 研究思路与方法 | 第18-21页 |
| 2.1 研究目标 | 第18页 |
| 2.2 研究内容 | 第18-20页 |
| 2.3 技术路线 | 第20-21页 |
| 文献综述 | 第21-27页 |
| 1 毛状根的研究现状 | 第21-22页 |
| 1.1 药用植物毛状根的研究现状 | 第21-22页 |
| 1.2 甘草毛状根的研究现状 | 第22页 |
| 2 甘草中黄酮类化合物的研究概况 | 第22-23页 |
| 2.1 黄酮类化合物研究概况 | 第22-23页 |
| 2.2 甘草中黄酮类化合物研究概况 | 第23页 |
| 3 黄酮类化合物生物合成途径功能基因的研究概况 | 第23-27页 |
| 3.1 CHS基因的研究进展 | 第24-25页 |
| 3.2 CHI基因的研究进展 | 第25-26页 |
| 3.3 甘草中有效成分含量变化分子机制研究现状 | 第26-27页 |
| 第一章 黄酮高含量甘草特异CHS、CHI基因单倍型筛选 | 第27-31页 |
| 1 实验材料 | 第27-28页 |
| 1.1 植物材料 | 第27-28页 |
| 2 实验方法 | 第28-29页 |
| 2.1 甘草特异CHS基因单倍型分析及筛选 | 第28页 |
| 2.2 甘草特异CHI基因单倍型分析及筛选 | 第28-29页 |
| 3 实验结果 | 第29-30页 |
| 3.1 黄酮高含量组特异CHS基因单倍型筛选结果 | 第29页 |
| 3.2 黄酮高含量组特异CHI基因单倍型筛选结果 | 第29-30页 |
| 4 小结与讨论 | 第30-31页 |
| 第二章 过表达甘草CHI、CHS基因植物双元表达载体的构建 | 第31-48页 |
| 1 实验材料 | 第31-32页 |
| 1.1 菌体及质粒 | 第31页 |
| 1.2 试剂 | 第31-32页 |
| 1.3 仪器及耗材 | 第32页 |
| 2 实验方法 | 第32-42页 |
| 2.1 含甘草CHI、CHS大肠杆菌工程菌的活化及重组质粒提取 | 第32-33页 |
| 2.2 植物双元表达载体pCAMBIA1305.1酶切位点的分析 | 第33-34页 |
| 2.3 连接引物设计 | 第34-36页 |
| 2.4 带酶切位点的基因片段PCR反应 | 第36-37页 |
| 2.5 PCR产物回收纯化 | 第37-38页 |
| 2.6 表达载体的构建 | 第38页 |
| 2.7 目的基因片段与表达载体双酶切产物的连接 | 第38-41页 |
| 2.8 重组质粒的转化 | 第41页 |
| 2.9 阳性克隆的筛选及测序 | 第41-42页 |
| 3 实验结果 | 第42-47页 |
| 3.1 含甘草CHI和CHS基因的重组T质粒提取结果 | 第42-43页 |
| 3.2 CHI和CHS基因扩增结果 | 第43页 |
| 3.3 pCAMBIA1305.1载体质粒提取结果 | 第43-44页 |
| 3.4 pCAMBIA1305.1载体双酶切结果 | 第44页 |
| 3.5 菌液PCR验证结果 | 第44-45页 |
| 3.6 菌液测序结果 | 第45-47页 |
| 4 小结与讨论 | 第47-48页 |
| 第三章 转甘草CHI、CHS基因发根农杆菌工程菌的构建 | 第48-57页 |
| 1 实验材料 | 第48页 |
| 1.1 菌体及质粒 | 第48页 |
| 1.2 试剂 | 第48页 |
| 1.3 仪器及耗材 | 第48页 |
| 2 实验方法 | 第48-52页 |
| 2.1 含重组pCA-CHI、pCA-CHS质粒大肠杆菌的活化 | 第48-49页 |
| 2.2 pCA-CHI、pCA-CHS质粒的提取 | 第49页 |
| 2.3 发根农杆菌ACCC10060的活化 | 第49页 |
| 2.4 发根农杆菌ACCC10060感受态细胞的制备 | 第49-50页 |
| 2.5 重组质粒pCA-CHI、pCA-CHS转化发根农杆菌 | 第50页 |
| 2.6 阳性克隆的筛选及PCR验证 | 第50-51页 |
| 2.7 测序结果分析 | 第51-52页 |
| 3 实验结果 | 第52-56页 |
| 3.1 pCA-CHI、pCA-CHS质粒提取结果 | 第52页 |
| 3.2 pCA-CHI、pCA-CHS质粒验证结果 | 第52-53页 |
| 3.3 rolC基因验证结果 | 第53-54页 |
| 3.4 测序结果 | 第54-56页 |
| 4 小结与讨论 | 第56-57页 |
| 第四章 过表达CHI、CHS基因甘草毛状根的诱导及培养 | 第57-67页 |
| 1 实验材料 | 第57页 |
| 1.1 菌体 | 第57页 |
| 1.2 试剂 | 第57页 |
| 1.3 仪器及耗材 | 第57页 |
| 2 实验方法 | 第57-60页 |
| 2.1 发根农杆菌工程菌的活化 | 第57-58页 |
| 2.2 转CHI、CHS基因发根农杆菌工程菌质粒提取 | 第58页 |
| 2.3 甘草外植体材料制备 | 第58页 |
| 2.4 侵染、共培养及除菌 | 第58-59页 |
| 2.5 甘草毛状根的PCR验证及测序验证 | 第59-60页 |
| 3 实验结果 | 第60-66页 |
| 3.1 甘草外植体培养情况 | 第60-61页 |
| 3.2 侵染及共培养情况 | 第61页 |
| 3.3 毛状根诱导情况 | 第61-62页 |
| 3.4 转CHI、CHS基因甘草毛状根验证 | 第62-66页 |
| 4 小结与讨论 | 第66-67页 |
| 第五章 UPLC法同时测定甘草毛状根中4种黄酮类成分含量 | 第67-83页 |
| 1 实验材料 | 第67页 |
| 1.1 植物材料 | 第67页 |
| 1.2 实验仪器 | 第67页 |
| 1.3 试剂 | 第67页 |
| 2 实验方法 | 第67-70页 |
| 2.1 甘草毛状根样品的培养 | 第67-68页 |
| 2.2 混合对照品溶液的制备 | 第68页 |
| 2.3 供试品制备 | 第68页 |
| 2.4 色谱条件 | 第68页 |
| 2.5 线性 | 第68-69页 |
| 2.6 检测限和定量限 | 第69页 |
| 2.7 重复性实验 | 第69页 |
| 2.8 精密度实验 | 第69页 |
| 2.9 稳定性实验 | 第69页 |
| 2.10 回收率实验 | 第69页 |
| 2.11 耐用性实验 | 第69-70页 |
| 2.12 毛状根样品的含量测定 | 第70页 |
| 3 实验结果 | 第70-82页 |
| 3.1 毛状根液体培养情况 | 第70页 |
| 3.2 UPLC方法学考察 | 第70-73页 |
| 3.3 甘草毛状根样品中4种黄酮类化合物的含量分析 | 第73-79页 |
| 3.4 相关性分析 | 第79-80页 |
| 3.5 差异性分析 | 第80-82页 |
| 4 小结与讨论 | 第82-83页 |
| 第六章 转基因甘草毛状根中CHS及CHI拷贝数的测定 | 第83-93页 |
| 1 实验材料 | 第83-84页 |
| 1.1 植物材料 | 第83页 |
| 1.2 实验仪器 | 第83页 |
| 1.3 试剂 | 第83-84页 |
| 2 实验方法 | 第84-87页 |
| 2.1 毛状根总DNA的提取 | 第84页 |
| 2.2 甘草CHI、CHS、Actin基因的获得 | 第84-86页 |
| 2.3 qRT-PCR标准曲线的建立 | 第86-87页 |
| 2.4 样品qRT-PCR扩增 | 第87页 |
| 3 实验结果 | 第87-92页 |
| 3.1 毛状根样品DNA提取 | 第87页 |
| 3.2 质粒标准品PCR及测序验证结果 | 第87-88页 |
| 3.3 qRT-PCR标准曲线的建立 | 第88-90页 |
| 3.4 熔解曲线分析 | 第90-91页 |
| 3.5 转CHI、CHS基因甘草毛状根中各目标基因拷贝数测定结果 | 第91-92页 |
| 4 小结与讨论 | 第92-93页 |
| 第七章 结语 | 第93-96页 |
| 1 总结 | 第93-94页 |
| 2 展望 | 第94-96页 |
| 参考文献 | 第96-103页 |
| 致谢 | 第103-104页 |
| 在学期间主要研究成果 | 第104页 |
