| 学位论文数据集 | 第3-4页 |
| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 符号说明 | 第7-14页 |
| 第一章 绪论 | 第14-24页 |
| 1.1 真核细胞的泛素化过程 | 第14-18页 |
| 1.1.1 泛素化过程概述 | 第14-15页 |
| 1.1.2 泛素(Ub) | 第15页 |
| 1.1.3 泛素化种类 | 第15-16页 |
| 1.1.4 26蛋白酶体 | 第16-17页 |
| 1.1.5 泛素化功能 | 第17-18页 |
| 1.2 嗜肺军团菌的泛素化过程 | 第18-22页 |
| 1.2.1 嗜肺军团菌 | 第18页 |
| 1.2.2 SdeA蛋白介导的泛素化 | 第18-19页 |
| 1.2.3 Dot/Icm Ⅳ型分泌系统 | 第19-21页 |
| 1.2.4 SdeA促进泛素的磷酸核糖基化 | 第21-22页 |
| 1.3 结构生物学 | 第22-23页 |
| 1.4 课题研究意义 | 第23-24页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第24-45页 |
| 2.1 实验仪器 | 第24页 |
| 2.2 实验材料 | 第24-26页 |
| 2.2.1 表达载体 | 第24页 |
| 2.2.2 实验室常用储液 | 第24页 |
| 2.2.3 实验室常用培养基 | 第24页 |
| 2.2.4 蛋白质纯化缓冲溶液 | 第24-25页 |
| 2.2.5 结晶条件试剂盒 | 第25-26页 |
| 2.3 分子克隆 | 第26-31页 |
| 2.3.1 PCR扩增目的基因 | 第26页 |
| 2.3.2 琼脂糖凝胶电泳及胶回收 | 第26-27页 |
| 2.3.3 酶切片段及载体 | 第27-28页 |
| 2.3.4 连接酶切后的载体和片段 | 第28-29页 |
| 2.3.5 连接产物转化 | 第29页 |
| 2.3.6 菌落鉴定 | 第29-30页 |
| 2.3.7 质粒小提 | 第30-31页 |
| 2.3.8 质粒PCR鉴定 | 第31页 |
| 2.4 蛋白纯化 | 第31-39页 |
| 2.4.1 目的蛋白表达纯化的基本步骤 | 第32-33页 |
| 2.4.2 镍柱亲和层析 | 第33-35页 |
| 2.4.3 GST标签融合蛋白纯化 | 第35-36页 |
| 2.4.4 透析纯化泛素 | 第36页 |
| 2.4.5 阳离子交换层析法纯化泛素 | 第36-37页 |
| 2.4.6 凝胶过滤层析(gel filtration chromatography) | 第37-39页 |
| 2.5 蛋白初筛及晶体优化 | 第39-43页 |
| 2.5.1 晶体生长原理 | 第39-40页 |
| 2.5.2 蛋白初筛 | 第40-41页 |
| 2.5.3 晶体的重复和优化 | 第41-42页 |
| 2.5.4 晶体防冻液 | 第42页 |
| 2.5.5 晶体衍射数据的收集与处理 | 第42-43页 |
| 2.6 功能实验 | 第43-45页 |
| 2.6.1 体外泛素化活性实验 | 第43页 |
| 2.6.2 分子动力学模拟实验 | 第43-44页 |
| 2.6.3 ADP-核糖基化泛素(ADPrUb)的制备 | 第44页 |
| 2.6.4 分析超速离心(AUC) | 第44页 |
| 2.6.5 质谱分析 | 第44-45页 |
| 第三章 SdeA及相关蛋白的表达纯化及晶体优化 | 第45-54页 |
| 3.1 SdeA表达载体的构建 | 第45页 |
| 3.2 SdeA~(231-1190)相关蛋白的表达纯化 | 第45-52页 |
| 3.2.1 SdeA~(231-1190)以pGEX6p-1载体的表达纯化 | 第46-47页 |
| 3.2.2 SdeA~(231-1190)以pET22b载体的表达纯化 | 第47页 |
| 3.2.3 泛素表达载体的构建 | 第47页 |
| 3.2.4 组氨酸标签泛素的表达纯化 | 第47-49页 |
| 3.2.5 无标签泛素的表达纯化 | 第49-51页 |
| 3.2.6 底物蛋白的表达纯化 | 第51-52页 |
| 3.3 SdeA~(231-1190)晶体筛选及优化 | 第52-53页 |
| 3.4 Ub-SdeA~(231-1190)晶体筛选及优化 | 第53-54页 |
| 第四章 SdeA的结构与功能 | 第54-69页 |
| 4.1 SdeA~(231-1190)的总体结构 | 第54-57页 |
| 4.1.1 SdeA~(231-1190)的结构分析 | 第54-55页 |
| 4.1.2 SdeA~(231-1190)以单体形式存在于溶液中 | 第55-56页 |
| 4.1.3 SdeA~(231-1190)与SdeA~(1-1499)具有相同的催化活性 | 第56-57页 |
| 4.2 SdeA~(mART)的结构 | 第57-60页 |
| 4.2.1 SdeA~(mART)结构的组成及其典型特征 | 第57-58页 |
| 4.2.2 SdeA~(mART)与SdeA~(PDE)之间的相互作用 | 第58-60页 |
| 4.3 SdeA~(mART)独特的泛素结合方式 | 第60-64页 |
| 4.3.1 SdeA~(231-1190)与三个泛素结合 | 第60页 |
| 4.3.2 SdeA~(mART)与Ub的结合方式及特异性催化 | 第60-62页 |
| 4.3.3 SdeA~(mART)氨基酸残基与Ub的相互作用 | 第62-64页 |
| 4.4 Ub-NADH-SdeA~(231-1190)复合物的结构 | 第64-68页 |
| 4.4.1 SdeA~(mART)催化反应的机制 | 第65-66页 |
| 4.4.2 分子模拟中Ub~(R72)和Ub~(R42)距离活性中心的位置变化 | 第66-67页 |
| 4.4.3 Ub~(R72)、Ub~(R74)和Ub~(R42)的作用机制 | 第67-68页 |
| 4.5 晶体信息 | 第68-69页 |
| 第五章 总结 | 第69-71页 |
| 5.1 实验总结 | 第69-70页 |
| 5.2 课题展望 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-75页 |
| 附录1 实验室常用储液配方 | 第75页 |
| 附录2 实验室常用培养基储液配方 | 第75-76页 |
| 附录3 实验室实验器械型号及厂家 | 第76-77页 |
| 附录4 蛋白纯化相关溶液 | 第77-78页 |
| 致谢 | 第78-79页 |
| 研究成果 | 第79-80页 |
| 作者及导师简介 | 第80-81页 |
| 附件 | 第81-82页 |
