| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 缩略语 | 第8-15页 |
| 第一章 绪论 | 第15-22页 |
| 1 猪流行性腹泻简介 | 第15-16页 |
| 2 猪流行性腹泻病毒结构及其基因组结构 | 第16-18页 |
| 2.1 猪流行性腹泻病毒非结构蛋白及其功能 | 第17-18页 |
| 2.2 猪流行性腹泻病毒结构蛋白及其功能 | 第18页 |
| 2.2.1 E蛋白及其功能 | 第18页 |
| 2.2.2 S蛋白及其功能 | 第18页 |
| 2.2.3 M蛋白及其功能 | 第18页 |
| 2.2.4 N蛋白及其功能 | 第18页 |
| 3 PEDV生活史 | 第18-19页 |
| 4 PEDV蛋白与宿主细胞相互作用蛋白的研究进展 | 第19-20页 |
| 5 冠状病毒E蛋白研究进展 | 第20-22页 |
| 5.1 E蛋白结构特点及功能 | 第20-21页 |
| 5.2 E蛋白缺失或突变对冠状病毒的影响 | 第21页 |
| 5.3 E蛋白与宿主细胞相互作用蛋白的研究进展 | 第21-22页 |
| 第二章 研究方案设计 | 第22-24页 |
| 1 研究目的与意义 | 第22页 |
| 2 研究内容 | 第22-23页 |
| 3 技术路线 | 第23-24页 |
| 第三章 PEDVE基因的克隆及真核表达载体构建 | 第24-42页 |
| 1 引言 | 第24页 |
| 2 实验材料、试剂与仪器 | 第24-27页 |
| 2.1 实验材料 | 第24页 |
| 2.2 主要试剂及试剂盒 | 第24页 |
| 2.3 主要试剂的配制 | 第24-26页 |
| 2.4 主要仪器 | 第26-27页 |
| 3 方法 | 第27-33页 |
| 3.1 PEDV感染PK-15细胞 | 第27-28页 |
| 3.1.1 PK-15细胞的复苏、传代培养及冻存 | 第27页 |
| 3.1.1.1 细胞复苏 | 第27页 |
| 3.1.1.2 细胞传代 | 第27页 |
| 3.1.1.3 细胞冻存 | 第27页 |
| 3.1.2 PEDV接种PK-15细胞及细胞的收集 | 第27-28页 |
| 3.2 PK-15细胞总RNA的提取及cDNA的合成 | 第28-29页 |
| 3.2.1 细胞总RNA的提取 | 第28页 |
| 3.2.2 RT-PCR | 第28-29页 |
| 3.3 PEDVE基因的pcDNA3系列重组质粒的构建 | 第29-33页 |
| 3.3.1 基因片段的扩增 | 第29-31页 |
| 3.3.2 pcDNA3空载质粒的提取 | 第31页 |
| 3.3.3 基因片段及pcDNA3质粒的双酶切、割胶回收 | 第31页 |
| 3.3.4 连接反应 | 第31-32页 |
| 3.3.5 CaCl2法制备E.coliTG1感受态细胞 | 第32页 |
| 3.3.6 连接产物的转化 | 第32-33页 |
| 3.3.7 重组质粒的提取及双酶切鉴定 | 第33页 |
| 3.3.8 重组质粒pcDNA3-His10-E、pcDNA3-MBP及pcDNA3-eGFP的测序及其重组菌的保种 | 第33页 |
| 3.3.9 PEDVE基因片段在重组质粒pcDNA3-MBP、pcDNA3-eGFP上的克隆 | 第33页 |
| 3.3.10 重组质粒测序及重组菌保种 | 第33页 |
| 4 结果分析 | 第33-41页 |
| 4.1 总RNA提取 | 第33-34页 |
| 4.2 His10-E、eGFP、MBP、E基因片段的PCR扩增 | 第34-35页 |
| 4.3 重组质粒双酶切鉴定 | 第35-36页 |
| 4.4 重组质粒序列测定 | 第36-41页 |
| 4.4.1 重组质粒测序结果 | 第36页 |
| 4.4.2 E基因的生物信息学分析 | 第36-41页 |
| 4.4.2.1 工具及方法 | 第36-37页 |
| 4.4.2.2 序列分析 | 第37-38页 |
| 4.4.2.3 结果 | 第38页 |
| 4.4.2.3 .1E基因序列及蛋白序列的系统发育树 | 第38-39页 |
| 4.4.2.3 .2E基因氨基酸序列保守性分析 | 第39-40页 |
| 4.4.2.3 .3E蛋白跨膜区预测 | 第40-41页 |
| 5 讨论 | 第41-42页 |
| 第四章 PEDVE基因的真核表达 | 第42-51页 |
| 1 引言 | 第42页 |
| 2 实验试剂与仪器 | 第42-44页 |
| 2.1 主要试剂及试剂盒 | 第42页 |
| 2.2 主要试剂的配制 | 第42-44页 |
| 2.3 主要仪器 | 第44页 |
| 3 方法 | 第44-46页 |
| 3.1 PK-15细胞转染条件的优化 | 第44-45页 |
| 3.1.1 质粒提取 | 第44页 |
| 3.1.2 转染条件的优化 | 第44-45页 |
| 3.2 WesternBlotting鉴定转染后蛋白的表达情况 | 第45-46页 |
| 4 结果分析 | 第46-50页 |
| 4.1 PK-15细胞转染条件的优化 | 第46-48页 |
| 4.2 重组质粒转染PK-15细胞后蛋白的表达鉴定 | 第48-50页 |
| 5 讨论 | 第50-51页 |
| 第五章 稳定表达MBP/MBP-E蛋白的PK-15细胞株的构建及宿主细胞相互作用蛋白的鉴定 | 第51-72页 |
| 1 引言 | 第51页 |
| 2 实验材料、试剂与仪器 | 第51-52页 |
| 2.1 实验材料 | 第51页 |
| 2.2 主要试剂及试剂盒 | 第51页 |
| 2.3 主要试剂的配制 | 第51-52页 |
| 3 方法 | 第52-58页 |
| 3.1 重组慢病毒载体的构建 | 第52-53页 |
| 3.1.1 基因片段的扩增 | 第52-53页 |
| 3.1.2 基因片段在CD513B-1质粒载体上的克隆 | 第53页 |
| 3.1.3 重组质粒的测序及其重组菌保种 | 第53页 |
| 3.2 细胞株的构建及筛选 | 第53-55页 |
| 3.2.1 MTT实验摸索嘌呤霉素最佳筛选浓度 | 第53-54页 |
| 3.2.2 293T细胞包装重组慢病毒 | 第54-55页 |
| 3.2.3 嘌呤霉素筛选细胞株 | 第55页 |
| 3.2.4 WesternBlotting检测目的蛋白表达情况 | 第55页 |
| 3.3 MBP-PullDown实验 | 第55-56页 |
| 3.3.1 目的蛋白PullDown | 第55-56页 |
| 3.3.2 WesternBlotting及银染鉴定 | 第56页 |
| 3.3.2.1 WesternBlotting鉴定 | 第56页 |
| 3.3.2.2 银染鉴定 | 第56页 |
| 3.4 质谱分析与PEDVE融合蛋白相互作用的蛋白 | 第56-58页 |
| 3.4.1 胶条样品准备 | 第56页 |
| 3.4.2 质谱分析 | 第56-58页 |
| 3.4.2.1 蛋白酶解 | 第56-57页 |
| 3.4.2.2 液相色谱-质谱联用分析 | 第57-58页 |
| 3.5 差异蛋白功能富集分析 | 第58页 |
| 4 结果分析 | 第58-70页 |
| 4.1 MBP、MBP-E基因片段的PCR扩增 | 第58-59页 |
| 4.2 重组质粒CD513B-1-MBP及CD513B-1-MBP-E的双酶切鉴定 | 第59-60页 |
| 4.3 重组质粒序列测定 | 第60页 |
| 4.4 不同浓度嘌呤霉素作用于PK-15细胞的MTT实验结果 | 第60页 |
| 4.5 重组慢病毒包装 | 第60-61页 |
| 4.6 细胞株的筛选及建立 | 第61-63页 |
| 4.7 MBP-PullDown结果鉴定 | 第63-64页 |
| 4.8 PEDVE蛋白相互作用蛋白的质谱分析 | 第64-70页 |
| 5 讨论 | 第70-72页 |
| 第六章 shRNA干扰PEDVE蛋白宿主细胞相互作用蛋白对病毒释放的影响 | 第72-86页 |
| 1 引言 | 第72页 |
| 2 实验材料、试剂与仪器 | 第72页 |
| 2.1 实验材料 | 第72页 |
| 2.2 主要试剂及试剂盒 | 第72页 |
| 2.3 主要试剂的配制 | 第72页 |
| 2.4 主要仪器 | 第72页 |
| 3 方法 | 第72-80页 |
| 3.1 shRNA干扰载体的构建 | 第72-77页 |
| 3.1.1 靶向目的基因的shRNA寡核苷酸链的设计与合成 | 第73-76页 |
| 3.1.1.1 目的基因GenBank登录号 | 第73页 |
| 3.1.1.2 shRNA寡核苷酸链的设计及合成 | 第73-76页 |
| 3.1.2 shRNA重组质粒的构建 | 第76-77页 |
| 3.1.2.1 shRNA寡核苷酸链双链退火 | 第76-77页 |
| 3.1.2.2 shRNA寡核苷酸链克隆至psi-LVRU6GP载体上 | 第77页 |
| 3.1.2.3 重组质粒的测序及其重组菌的保种 | 第77页 |
| 3.2 稳定表达shRNA的细胞株的构建及鉴定 | 第77-79页 |
| 3.3 稳定表达shRNA的细胞株对PEDV释放的影响 | 第79-80页 |
| 3.3.1 PEDV的培养与收集 | 第79页 |
| 3.3.2 PEDV感染稳定表达shRNA的细胞株 | 第79页 |
| 3.3.3 干扰目的基因对PEDV释放的影响 | 第79-80页 |
| 4 结果分析 | 第80-84页 |
| 4.1 shRNA干扰效果的鉴定 | 第80-82页 |
| 4.2 干扰目的基因后对PEDV释放的影响 | 第82-84页 |
| 5 讨论 | 第84-86页 |
| 结论 | 第86-87页 |
| 参考文献 | 第87-92页 |
| 附录 | 第92-93页 |
| 致谢 | 第93页 |
