| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 符号说明 | 第8-9页 |
| 第一章 文献综述 | 第9-16页 |
| 1 引言 | 第9页 |
| 2 转基因大豆的研究进展 | 第9-13页 |
| 2.1 真菌病害对大豆的影响 | 第9-11页 |
| 2.1.1 大豆主要的真菌性病害 | 第9-10页 |
| 2.1.2 大豆病害的防治手段 | 第10-11页 |
| 2.2 转基因大豆的优势和存在的问题 | 第11-12页 |
| 2.2.1 转基因大豆的现状 | 第11页 |
| 2.2.2 大豆转基因育种的优势 | 第11-12页 |
| 2.3 农杆菌介导的大豆遗传转化 | 第12-13页 |
| 3 天麻抗真菌蛋白(GAFP)具有广谱抗真菌活性 | 第13页 |
| 4 大豆基因组DNA的甲基化研究进展 | 第13-15页 |
| 5 本研究的目的和意义 | 第15页 |
| 6 本研究的技术路线 | 第15-16页 |
| 第二章 大豆组织培养过程中甲基化的分析 | 第16-24页 |
| 1 实验材料及方法 | 第16-19页 |
| 1.1 实验材料 | 第16-17页 |
| 1.2 DNA 5-~mC含量的测定方法 | 第17页 |
| 1.3 甲基化酶基因及引物 | 第17-18页 |
| 1.4 CMT2和DDM1基因的相对表达量测定 | 第18-19页 |
| 1.4.1 大豆总RNA的提取方法 | 第18页 |
| 1.4.2 反转录合成cDNA | 第18-19页 |
| 1.4.3 qRT-PCR检测 | 第19页 |
| 2 实验结果与分析 | 第19-22页 |
| 2.1 DNA甲基化水平测定 | 第19-20页 |
| 2.2 不同6-BA浓度对大豆再生芽甲基化的影响 | 第20-21页 |
| 2.3 不同诱导时间对大豆再生芽甲基化的影响 | 第21页 |
| 2.4 农杆菌侵染时间对大豆再生芽甲基化的影响 | 第21-22页 |
| 3 讨论 | 第22-24页 |
| 第三章 农杆菌介导的GAFP基因转化大豆 | 第24-31页 |
| 1 实验材料 | 第24-25页 |
| 1.1 植物材料和菌株 | 第24页 |
| 1.2 质粒载体 | 第24页 |
| 1.3 培养基成分 | 第24-25页 |
| 2 实验方法 | 第25-27页 |
| 2.1 农杆菌介导大豆转化的实验步骤 | 第25-26页 |
| 2.2 转基因植株基因组DNA的PCR检测 | 第26-27页 |
| 2.2.1 基因组DNA的提取 | 第26页 |
| 2.2.2 转GAFP基因T_0代再生植株PCR扩增 | 第26-27页 |
| 3 结果与分析 | 第27-29页 |
| 3.1 转基因大豆的获得 | 第27-28页 |
| 3.2 转基因植株的PCR鉴定 | 第28页 |
| 3.3 转基因植株DNA测序 | 第28-29页 |
| 4 讨论 | 第29-31页 |
| 第四章 转GAFP基因T_0代植株抗病性及生理指标测定 | 第31-39页 |
| 1 抗病性鉴定 | 第31-34页 |
| 1.1 实验材料 | 第31页 |
| 1.2 实验方法 | 第31-32页 |
| 1.2.1 培养基制备 | 第31页 |
| 1.2.2 菌核灭菌 | 第31页 |
| 1.2.3 菌丝培养 | 第31-32页 |
| 1.2.4 菌核病苗期离体叶片接种方法 | 第32页 |
| 1.3 结果与分析 | 第32-33页 |
| 1.4 讨论 | 第33-34页 |
| 2 转基因大豆T_0代植株的生理指标测定 | 第34-39页 |
| 2.1 实验材料 | 第34页 |
| 2.2 实验方法 | 第34-37页 |
| 2.2.1 菌核病茎杆接种实验方法 | 第34-35页 |
| 2.2.2 丙二醛(MDA)含量测定方法(TBA法) | 第35页 |
| 2.2.3 过氧化物酶(POD)含量测定方法(愈创木酚法) | 第35-36页 |
| 2.2.4 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定(NBT法) | 第36-37页 |
| 2.3 结果与分析 | 第37页 |
| 2.4 讨论 | 第37-39页 |
| 第五章 蛭石培养的农杆菌介导大豆转化方法的建立 | 第39-49页 |
| 1 载体pc3301-121-SG_3的构建 | 第39-45页 |
| 1.1 实验材料 | 第39页 |
| 1.2 实验方法 | 第39-41页 |
| 1.2.1 大肠杆菌感受态的制备和转化 | 第39-40页 |
| 1.2.2 质粒DNA的提取 | 第40页 |
| 1.2.3 质粒转化农杆菌(EHA105) | 第40页 |
| 1.2.4 酶切反应体系 | 第40-41页 |
| 1.2.5 连接反应体系 | 第41页 |
| 1.3 实验结果 | 第41-45页 |
| 1.3.1 构建载体pc3301-121-SG_3的流程 | 第41-42页 |
| 1.3.2 设计含酶切位点引物 | 第42页 |
| 1.3.3 制备含酶切位点的SG_3载体 | 第42-43页 |
| 1.3.4 SG_3片段连结启动子和终止子 | 第43-44页 |
| 1.3.5 SG_3连结载体pc3301 | 第44页 |
| 1.3.6 pc3301-PBI121-SG_3质粒测序 | 第44-45页 |
| 1.3.7 pc3301-PBI121-SG_3质粒转化农杆菌 | 第45页 |
| 2 利用蛭石培养的农杆菌介导大豆转化 | 第45-49页 |
| 2.1 实验材料 | 第45-46页 |
| 2.2 实验方法 | 第46页 |
| 2.3 结果及分析 | 第46-48页 |
| 2.3.1 蛭石培养法获得大豆再生植株 | 第46-47页 |
| 2.3.2 获得再生植株的PCR阳性鉴定 | 第47-48页 |
| 2.4 讨论 | 第48-49页 |
| 参考文献 | 第49-54页 |
| 附录 | 第54-58页 |
| 致谢 | 第58-59页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第59-60页 |
