| 目录 | 第4-7页 |
| 中文摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 符号说明及缩略词 | 第12-13页 |
| 第一章 研究背景和立题依据 | 第13-27页 |
| 1.1 研究背景 | 第13-24页 |
| 1.1.1 蛋白酶的概述 | 第13-15页 |
| 1.1.1.1 金属蛋白酶 | 第13-14页 |
| 1.1.1.2 Thermolysin家族金属蛋白酶 | 第14页 |
| 1.1.1.3 Thermolysin家族金属蛋白酶的成熟机制 | 第14页 |
| 1.1.1.4 Thermolysin家族金属蛋白酶的催化机制 | 第14-15页 |
| 1.1.2 酯类水解酶概述 | 第15-18页 |
| 1.1.2.1 酯类水解酶的催化机制 | 第16-17页 |
| 1.1.2.2 酯酶/脂肪酶的分泌机制 | 第17-18页 |
| 1.1.2.3 酯酶/脂肪酶的应用 | 第18页 |
| 1.1.3 宏基因组学 | 第18-21页 |
| 1.1.3.1 宏基因组学(Metagenome)的产生与定义 | 第18-19页 |
| 1.1.3.2 宏基因组学的常用研究技术 | 第19-20页 |
| 1.1.3.3 宏基因组学的用途 | 第20-21页 |
| 1.1.4 功能宏基因组在研究在蛋白酶、酯酶/脂肪酶方面的研究进展 | 第21-22页 |
| 1.1.5 采样位点信息介绍 | 第22-24页 |
| 1.1.5.1 北极黄河站王湾生态环境 | 第22-23页 |
| 1.1.5.2 大西洋TVG 5/7位点信息 | 第23-24页 |
| 1.1.5.3 海洋沉积物概述 | 第24页 |
| 1.2 立题依据和研究内容 | 第24-27页 |
| 1.2.1 立题依据 | 第24-26页 |
| 1.2.2 研究内容 | 第26-27页 |
| 第二章 通过构建宏基因组文库筛选北极、大西洋海底沉积物中的蛋白酶、酯类水解酶基因 | 第27-42页 |
| 2.1 引言 | 第27页 |
| 2.2 实验材料 | 第27-29页 |
| 2.2.1 环境样品及实验菌株 | 第27-28页 |
| 2.2.2 培养基 | 第28页 |
| 2.2.3 主要试剂和试剂盒 | 第28-29页 |
| 2.2.4 主要仪器设备 | 第29页 |
| 2.2.5 数据库和分析软件 | 第29页 |
| 2.3 实验方法 | 第29-34页 |
| 2.3.1 环境样品的采集 | 第29-30页 |
| 2.3.2 环境样品基因组DNA提取 | 第30页 |
| 2.3.3 环境样品基因组DNA的纯化 | 第30-31页 |
| 2.3.4 宏基因组文库的构建 | 第31-32页 |
| 2.3.4.1 末端补平 | 第31页 |
| 2.3.4.2 连接反应 | 第31-32页 |
| 2.3.4.3 受体细胞的制备 | 第32页 |
| 2.3.4.4 包装、转染反应 | 第32页 |
| 2.3.5 宏基因组文库的功能筛选和克隆子纯化 | 第32-33页 |
| 2.3.6 亚克隆文库的构建以及活性筛选 | 第33-34页 |
| 2.3.6.1 EPI300电转感受态的制备 | 第33页 |
| 2.3.6.2 亚克隆重组载体的制备 | 第33页 |
| 2.3.6.3 电转反应 | 第33-34页 |
| 2.3.6.4 活性筛选 | 第34页 |
| 2.3.7 蛋白酶基因的获取和序列分析 | 第34页 |
| 2.4 结果与分析 | 第34-40页 |
| 2.4.1 北极海底沉积物宏基因组文库的构建 | 第34-35页 |
| 2.4.2 大西洋深海表层沉积物fosmid宏基因组文库的构建 | 第35-36页 |
| 2.4.3 Fosmid宏基因组的活性筛选及克隆子纯化 | 第36-38页 |
| 2.4.3.1 北极沉积物样品fosmid宏基因组文库的活性筛选以及阳性克隆的纯化 | 第36-37页 |
| 2.4.3.2 大西洋深海沉积物样品fosmid宏基因组文库TVG5/7的活性筛选以及阳性克隆的纯化 | 第37-38页 |
| 2.4.4 通过构建亚克隆文库确定编码蛋白酶的基因序列 | 第38-39页 |
| 2.4.5 编码蛋白酶基因的序列分析 | 第39-40页 |
| 2.5 讨论 | 第40-42页 |
| 第三章 蛋白酶的异源表达及其酶学性质研究 | 第42-63页 |
| 3.1 引言 | 第42页 |
| 3.2 实验材料 | 第42-44页 |
| 3.2.1 环境样品及实验菌株 | 第42页 |
| 3.2.2 培养基 | 第42页 |
| 3.2.3 主要试剂和试剂盒 | 第42-43页 |
| 3.2.4 主要仪器设备 | 第43页 |
| 3.2.5 数据库和分析软件 | 第43-44页 |
| 3.3 实验方法 | 第44-48页 |
| 3.3.1 蛋白酶3C的基因克隆 | 第44页 |
| 3.3.2 重组酶的异源表达 | 第44-45页 |
| 3.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测 | 第45页 |
| 3.3.4 胞内蛋白酶的分离纯化 | 第45页 |
| 3.3.5 胞外蛋白酶的分离纯化 | 第45-46页 |
| 3.3.6 蛋白酶的活性检测 | 第46-47页 |
| 3.3.7 蛋白浓度测定 | 第47页 |
| 3.3.8 最适反应温度及温度稳定性分析 | 第47页 |
| 3.3.9 最适反应pH | 第47-48页 |
| 3.3.10 NaCl对酶活性的影响 | 第48页 |
| 3.3.11 金属离子对酶活性的影响 | 第48页 |
| 3.3.12 抑制剂与变性剂对酶活性的影响 | 第48页 |
| 3.4 结果与分析 | 第48-61页 |
| 3.4.0 蛋白酶3C的基因克隆 | 第48-49页 |
| 3.4.1 蛋白酶3C基因序列分析以及结构域分析 | 第49-51页 |
| 3.4.2 蛋白酶3C的异源表达 | 第51-52页 |
| 3.4.3 胞内蛋白酶3C的分离纯化及活性检测 | 第52-53页 |
| 3.4.4 胞外蛋白酶3C的表达及纯化 | 第53-56页 |
| 3.4.4.1 酪氨酸标准曲线的制作 | 第53-54页 |
| 3.4.4.2 发酵条件的优化 | 第54页 |
| 3.4.4.3 胞外蛋白酶3C的纯化 | 第54-55页 |
| 3.4.4.4 蛋白酶3C活性的检测 | 第55-56页 |
| 3.4.5 蛋白酶3C Superdex-75凝胶过滤层析纯化效果分析 | 第56-57页 |
| 3.4.6 蛋白酶3C底物特异性分析 | 第57页 |
| 3.4.7 最适反应温度及温度稳定性分析 | 第57-58页 |
| 3.4.8 最适pH分析 | 第58-59页 |
| 3.4.9 NaCl对酶活的影响 | 第59页 |
| 3.4.10 金属离子对酶活的影响 | 第59-60页 |
| 3.4.11 抑制剂对酶活的影响 | 第60-61页 |
| 3.5 讨论 | 第61-63页 |
| 全文总结与展望 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-69页 |
| 致谢 | 第69-70页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第70页 |
