| 目录 | 第1-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 1 前言 | 第10-16页 |
| ·生物能源开发的重要性及现状 | 第10页 |
| ·木质纤维素的酶降解系统 | 第10-12页 |
| ·开发瘤胃微生物纤维素酶的意义及研究进展 | 第12-14页 |
| ·双功能木聚糖酶/内切葡聚糖酶研究进展 | 第14页 |
| ·题背景和研究内容 | 第14-16页 |
| 2 材料和方法 | 第16-32页 |
| ·材料 | 第16-20页 |
| ·菌株 | 第16页 |
| ·质粒 | 第16页 |
| ·引物 | 第16-17页 |
| ·主要试剂 | 第17页 |
| ·主要仪器设备 | 第17-18页 |
| ·培养基和常用溶液 | 第18-20页 |
| ·方法 | 第20-32页 |
| ·分子克隆实验技术 | 第20-25页 |
| ·PCR | 第20-21页 |
| ·酶切反应体系 | 第21页 |
| ·连接反应 | 第21页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第21-22页 |
| ·大肠杆菌转化子鉴定和测序 | 第22页 |
| ·质粒小型抽提 | 第22-23页 |
| ·质粒大型抽提 | 第23-24页 |
| ·琼脂糖电泳DNA片段回收 | 第24页 |
| ·SDS-PAGE蛋白电泳 | 第24-25页 |
| ·Cosmid质粒DNA的亚克隆文库的构建及筛选 | 第25页 |
| ·生物信息学分析 | 第25页 |
| ·蛋白同源性及进化树分析 | 第25页 |
| ·蛋白结构域分析 | 第25页 |
| ·大肠杆菌内重组蛋白的诱导表达 | 第25-26页 |
| ·大肠杆菌内重组蛋白的Ni-NTA亲和纯化 | 第26页 |
| ·酵母工程菌筛选及蛋白表达纯化 | 第26-28页 |
| ·毕赤酵母表达质粒的构建 | 第26页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞的制备及电转化 | 第26-27页 |
| ·酵母转化子的鉴定 | 第27页 |
| ·高分泌表达毕赤酵母工程菌的筛选 | 第27页 |
| ·蛋白表达产物的透析纯化 | 第27-28页 |
| ·RuCelA内切葡聚糖酶及木聚糖酶活性的酶学属性研究 | 第28-30页 |
| ·葡萄糖、木糖标准曲线的绘制 | 第28页 |
| ·酶活及最适温度、最适pH值测定、酶的热稳定性 | 第28-29页 |
| ·酶动力学参数的测定 | 第29页 |
| ·金属离子对酶活的影响 | 第29页 |
| ·酶的底物特异性测定 | 第29-30页 |
| ·酶解产物的TLC及HPAEC分析 | 第30页 |
| ·酶的功能研究 | 第30-32页 |
| ·酶的协同作用分析 | 第30页 |
| ·酶对预处理稻草的水解 | 第30-32页 |
| 3 结果 | 第32-44页 |
| ·Cosmid文库插入外源DNA片段的分析 | 第32页 |
| ·内切葡聚糖酶阳性克隆的筛选及RuCelA基因的序列分析 | 第32-34页 |
| ·RuCelA在大肠杆菌内的重组表达 | 第34页 |
| ·重组RuCelA的酶学属性分析 | 第34-38页 |
| ·酶的最适条件、热稳定性、pH稳定性及动力学分析 | 第34-35页 |
| ·金属离子对RuCelA酶活的影响 | 第35-36页 |
| ·RuCelA的底物特异性 | 第36-37页 |
| ·RuCelA的水解模式分析 | 第37-38页 |
| ·重组RuCelA的功能研究 | 第38-41页 |
| ·RuCelA与木糖苷酶xyl1、葡萄糖苷酶Bgl间的协同作用 | 第38-39页 |
| ·RuCelA与木聚糖酶Xyn-CDBFV、葡聚糖酶RuCelB对预处理稻草的水解能力比较 | 第39-40页 |
| ·RuCelA水解木聚糖、大麦葡聚糖及预处理稻草的产物分析 | 第40-41页 |
| ·毕赤酵母内重组目的蛋白的表达 | 第41-44页 |
| ·酵母表达工程菌的构建 | 第41-42页 |
| ·高拷贝菌株的筛选和重组蛋白在酵母中的表达 | 第42页 |
| ·与大肠杆菌表达重组蛋白间的比较 | 第42-44页 |
| 4 讨论 | 第44-48页 |
| ·瘤胃宏基因组文库的功能筛选 | 第44页 |
| ·RuCelA的酶学属性 | 第44-45页 |
| ·RuCelA的功能研究 | 第45-46页 |
| ·稻草预处理策略 | 第46页 |
| ·酵母表达重组蛋白的优势及劣势 | 第46-48页 |
| 5 结论 | 第48-49页 |
| 参考文献 | 第49-54页 |
| 致谢 | 第54-56页 |
| 硕士期间发表论文及专利 | 第56-57页 |
