| 摘要 | 第6-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 文献综述 | 第17-40页 |
| 第一章 猪圆环病毒2型研究进展 | 第17-40页 |
| 1.1 病原学 | 第17-29页 |
| 1.1.1 病毒的发现与分类 | 第17-18页 |
| 1.1.2 病毒粒子特征 | 第18-19页 |
| 1.1.3 化学组成与功能 | 第19页 |
| 1.1.4 病毒基因组结构及其编码蛋白研究进展 | 第19-25页 |
| 1.1.5 病毒复制 | 第25-27页 |
| 1.1.6 病毒转录 | 第27-29页 |
| 1.2 流行病学 | 第29页 |
| 1.2.1 传染源 | 第29页 |
| 1.2.2 易感动物 | 第29页 |
| 1.2.3 传播途径及特点 | 第29页 |
| 1.3 临床表现与病理变化 | 第29-31页 |
| 1.3.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征 | 第30页 |
| 1.3.2 仔猪先天性震颤 | 第30页 |
| 1.3.3 成年猪皮炎肾炎综合征 | 第30页 |
| 1.3.4 增生性坏死性肺炎 | 第30-31页 |
| 1.3.5 肠炎 | 第31页 |
| 1.3.6 母猪繁殖障碍 | 第31页 |
| 1.3.7 猪呼吸道疾病综合征 | 第31页 |
| 1.4 致病机理 | 第31-34页 |
| 1.4.1 病毒感染的靶器官与靶细胞 | 第31页 |
| 1.4.2 病毒配体表位与靶细胞受体 | 第31-32页 |
| 1.4.3 病毒入侵 | 第32页 |
| 1.4.4 病毒释放 | 第32-33页 |
| 1.4.5 病毒致病机理 | 第33-34页 |
| 1.5 病毒对外界环境的抵抗力 | 第34页 |
| 1.6 疾病流行历史与现状 | 第34-35页 |
| 1.7 疾病的诊断 | 第35-36页 |
| 1.7.1 抗原检测技术 | 第35-36页 |
| 1.7.2 抗体检测技术 | 第36页 |
| 1.8 疾病的防控形势与防控措施 | 第36-40页 |
| 1.8.1 疾病的防控形势 | 第36-37页 |
| 1.8.2 疾病的防控措施 | 第37-40页 |
| 试验研究 | 第40-154页 |
| 第二章 ORF5编码蛋白基因与蛋白水平的鉴定 | 第40-73页 |
| 2.1 材料 | 第41-43页 |
| 2.1.1 细胞、病毒与实验动物 | 第41页 |
| 2.1.2 主要试剂、耗材、抗体及试剂盒 | 第41-42页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第42-43页 |
| 2.2 方法 | 第43-59页 |
| 2.2.1 主要溶液配制 | 第43-44页 |
| 2.2.2 pGEX-ORF5、pc DNA-ORF5和pEGFP-ORF5质粒的构建与鉴定 | 第44-48页 |
| 2.2.3 细胞培养与猪圆环病毒2型的扩增及其感染复数的确定 | 第48页 |
| 2.2.4 猪肺泡巨噬细胞接种PCV2及病毒增殖的定量PCR检测 | 第48-50页 |
| 2.2.5 ORF5转录本的RT-PCR验证 | 第50-51页 |
| 2.2.6 ORF5转录本的Northern blot验证 | 第51-53页 |
| 2.2.7 ORF5编码蛋白的多克隆抗体制备 | 第53-56页 |
| 2.2.8 ORF5编码蛋白抗体的特异性鉴定 | 第56-58页 |
| 2.2.9 ORF5编码蛋白表达的IFA和Western验证 | 第58-59页 |
| 2.3 结果 | 第59-70页 |
| 2.3.1 ORF5基因的PCR扩增 | 第59-60页 |
| 2.3.2 pGEX-ORF5、pc DNA-ORF5和pEGFP-ORF5质粒的酶切鉴定 | 第60页 |
| 2.3.3 猪圆环病毒2型在猪肺泡巨噬细胞中增殖检测 | 第60-63页 |
| 2.3.4 RT-PCR检测ORF5基因转录 | 第63页 |
| 2.3.5 Northern blot检测ORF5转录本 | 第63-65页 |
| 2.3.6 ORF5编码蛋白多克隆抗体的制备 | 第65-68页 |
| 2.3.7 ORF5编码蛋白抗体的特异性鉴定 | 第68-69页 |
| 2.3.8 IFA和Western blot检测ORF5编码蛋白的表达 | 第69-70页 |
| 2.4 讨论 | 第70-72页 |
| 2.5 小结 | 第72-73页 |
| 第三章 ORF5编码蛋白的功能研究 | 第73-96页 |
| 3.1 材料 | 第73-74页 |
| 3.1.1 细胞、病毒与质粒 | 第73页 |
| 3.1.2 主要试剂、抗体及试剂盒 | 第73-74页 |
| 3.1.3 主要仪器设备 | 第74页 |
| 3.2 方法 | 第74-81页 |
| 3.2.1 主要溶液配制 | 第74页 |
| 3.2.2 PCV2 ORF5缺失体构建及其对病毒复制的影响 | 第74-76页 |
| 3.2.3 定量RT-PCR检测PCV2各编码蛋白基因水平的表达动力学 | 第76-77页 |
| 3.2.4 真核表达载体转染猪肺泡巨噬细胞 | 第77页 |
| 3.2.5 表达蛋白的荧光检测与Western blot鉴定 | 第77-78页 |
| 3.2.6 CCK-8 检测ORF5编码蛋白对细胞增殖的影响 | 第78页 |
| 3.2.7 流式细胞仪检测ORF5编码蛋白对细胞周期的影响 | 第78页 |
| 3.2.8 流式细胞仪与RT-qPCR检测ORF5编码蛋白对细胞凋亡的影响 | 第78-79页 |
| 3.2.9 激光共聚焦显微镜观察ORF5编码蛋白的亚细胞定位 | 第79页 |
| 3.2.10 ORF5编码蛋白对细胞内质网应激相关分子基因转录与表达的影响 | 第79-81页 |
| 3.2.11 Western blot检测ORF5编码蛋白的降解特征 | 第81页 |
| 3.3 结果 | 第81-93页 |
| 3.3.1 PCV2 ORF5缺失体构建及其对病毒复制的影响 | 第81-83页 |
| 3.3.2 PCV2各基因的转录动力学分析 | 第83-84页 |
| 3.3.3 真核表达载体转染猪肺泡巨噬细胞及表达蛋白的鉴定 | 第84-86页 |
| 3.3.4 ORF5编码蛋白对细胞增殖的影响 | 第86-87页 |
| 3.3.5 ORF5编码蛋白对细胞周期的影响 | 第87-88页 |
| 3.3.6 ORF5编码蛋白对细胞凋亡的影响 | 第88-89页 |
| 3.3.7 ORF5编码蛋白的亚细胞定位观察 | 第89-90页 |
| 3.3.8 ORF5编码蛋白对细胞内质网应激的影响 | 第90-93页 |
| 3.3.9 ORF5编码蛋白降解特征的研究 | 第93页 |
| 3.4 讨论 | 第93-95页 |
| 3.5 小结 | 第95-96页 |
| 第四章 酵母双杂交筛选与PCV2 ORF4和ORF5蛋白相互作用的蛋白 | 第96-120页 |
| 4.1 材料 | 第96-98页 |
| 4.1.1 菌株、细胞与质粒 | 第96页 |
| 4.1.2 主要试剂及试剂盒 | 第96-97页 |
| 4.1.3 培养基及其配制 | 第97-98页 |
| 4.1.4 主要仪器设备 | 第98页 |
| 4.2 方法 | 第98-104页 |
| 4.2.1 诱饵载体pGBKT7-ORF4和pGBKT7-ORF5的构建及鉴定 | 第98-99页 |
| 4.2.2 重组质粒pGBKT7-ORF4和pGBKT7-ORF5毒性与自激活检测 | 第99-100页 |
| 4.2.3 猪肺泡巨噬细胞cDNA文库的制备 | 第100-102页 |
| 4.2.4 酵母双杂交筛选(Y2H与Y187交配实验) | 第102-103页 |
| 4.2.5 阳性菌落的鉴定 | 第103-104页 |
| 4.2.6 文库质粒的解救与测序 | 第104页 |
| 4.3 结果 | 第104-116页 |
| 4.3.1 诱饵质粒pGBKT7-ORF4和pGBKT7-ORF5的构建与双酶切鉴定 | 第104-106页 |
| 4.3.2 酵母菌落PCR鉴定 | 第106-107页 |
| 4.3.3 诱饵蛋白毒性与自激活检测 | 第107-108页 |
| 4.3.4 猪肺泡巨噬细胞总RNA的提取与纯度分析 | 第108-109页 |
| 4.3.5 cDNA的合成与纯化 | 第109-110页 |
| 4.3.6 猪肺泡巨噬细胞cDNA文库的构建 | 第110-111页 |
| 4.3.7 酵母双杂交 | 第111页 |
| 4.3.8 阳性克隆筛选结果 | 第111-113页 |
| 4.3.9 阳性克隆的鉴定 | 第113-114页 |
| 4.3.10 测序结果 | 第114-116页 |
| 4.4 讨论 | 第116-118页 |
| 4.5 小结 | 第118-120页 |
| 第五章 PCV2 ORF4蛋白拮抗细胞凋亡机制的研究 | 第120-154页 |
| 5.1 材料 | 第120-121页 |
| 5.1.1 病毒、细胞与质粒 | 第120-121页 |
| 5.1.2 主要试剂、抗体及试剂盒 | 第121页 |
| 5.1.3 主要仪器设备 | 第121页 |
| 5.2 方法 | 第121-130页 |
| 5.2.1 主要缓冲液及试剂的配制 | 第121页 |
| 5.2.2 原核与真核表达载体的构建和鉴定 | 第121-122页 |
| 5.2.3 真核表达载体pEGFP-C1和pEGFP-ORF4的转染与稳转筛选 | 第122页 |
| 5.2.4 重组慢病毒载体的构建与病毒包装 | 第122-125页 |
| 5.2.5 PCV2 ORF4缺失体的构建 | 第125-126页 |
| 5.2.6 流式细胞仪检测ORF4蛋白对细胞凋亡的影响 | 第126页 |
| 5.2.7 流式细胞仪检测ORF4蛋白对PCV2致凋亡作用的影响 | 第126页 |
| 5.2.8 流式细胞仪检测ORF4蛋白对ORF3蛋白促凋亡作用的影响 | 第126页 |
| 5.2.9 qRT-PCR检测ORF4蛋白对ORF3蛋白基因转录的影响 | 第126页 |
| 5.2.10 GST pull-down验证ORF4蛋白与FHC的相互作用 | 第126-127页 |
| 5.2.11 激光共聚焦研究ORF4蛋白与FHC在细胞中的共定位情况 | 第127页 |
| 5.2.12 Co-IP验证ORF4蛋白与FHC的相互作用 | 第127-128页 |
| 5.2.13 流式细胞仪检测FHC对PCV2诱导凋亡作用的影响 | 第128-129页 |
| 5.2.14 qRT-PCR检测ORF4蛋白对细胞FHC转录的影响 | 第129页 |
| 5.2.15 Western blot检测ORF4蛋白对细胞FHC表达的影响 | 第129页 |
| 5.2.16 酶标仪检测ORF4蛋白对细胞ROS水平的影响 | 第129-130页 |
| 5.3 结果 | 第130-151页 |
| 5.3.1 原核与真核表达载体的构建与双酶切鉴定 | 第130-131页 |
| 5.3.2 GFP与GFP-ORF4蛋白稳定表达细胞系的建立与表达鉴定 | 第131-132页 |
| 5.3.3 GST-ORF4蛋白的体外诱导表达与纯化 | 第132-134页 |
| 5.3.4 重组慢病毒的包装与病毒滴度的测定 | 第134-137页 |
| 5.3.5 慢病毒介导的基因过表达与干扰效果的鉴定 | 第137-139页 |
| 5.3.6 ORF4蛋白对细胞凋亡的影响 | 第139-140页 |
| 5.3.7 ORF4蛋白对PCV2致凋亡作用的影响 | 第140-142页 |
| 5.3.8 ORF4蛋白对ORF3蛋白促凋亡作用的影响 | 第142-143页 |
| 5.3.9 ORF4蛋白对ORF3蛋白基因转录的影响 | 第143页 |
| 5.3.10 GST pull-down验证ORF4蛋白与FHC的相互作用 | 第143-144页 |
| 5.3.11 激光共聚焦研究ORF4蛋白与FHC在细胞中的共定位情况 | 第144-145页 |
| 5.3.12 Co-IP验证ORF4蛋白与FHC的相互作用 | 第145-147页 |
| 5.3.13 FHC对PCV2诱导凋亡作用的影响 | 第147-148页 |
| 5.3.14 ORF4蛋白对细胞FHC基因转录的影响 | 第148-149页 |
| 5.3.15 ORF4蛋白对细胞FHC蛋白表达的影响 | 第149-150页 |
| 5.3.16 ORF4蛋白对细胞ROS水平的影响 | 第150-151页 |
| 5.4 讨论 | 第151-153页 |
| 5.5 小结 | 第153-154页 |
| 结论 | 第154页 |
| 本文的创新点 | 第154-155页 |
| 参考文献 | 第155-167页 |
| 缩略词 | 第167-169页 |
| 致谢 | 第169-170页 |
| 作者简介 | 第170页 |
