| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-11页 |
| 缩略语表（Abbreviation） | 第12-13页 |
| 1 前言 | 第13-39页 |
| 1.1 研究问题的由来 | 第13页 |
| 1.2 转LTF基因家畜研究进展 | 第13-15页 |
| 1.3 基因编辑家畜研究进展 | 第15-18页 |
| 1.3.1 随机插入方式获得转基因家畜 | 第15-18页 |
| 1.3.2 定点编辑猪基因组的发展 | 第18页 |
| 1.4 核酸内切酶应用于基因组编辑 | 第18-24页 |
| 1.4.1 断裂DNA的修复 | 第19-21页 |
| 1.4.2 锌指核酸酶技术及其在猪基因组上的应用 | 第21-22页 |
| 1.4.3 转录激活因子样效应物核酸酶及其在猪上的应用 | 第22-24页 |
| 1.5 CRISPR/Cas技术 | 第24-35页 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas系统的研究历程 | 第24-25页 |
| 1.5.2 CRISPR/Cas系统抵御外来核苷酸入侵 | 第25-28页 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9系统的优化发展 | 第28-29页 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9系统的应用 | 第29-31页 |
| 1.5.5 CRISPR/Cas9的脱靶问题及解决方案 | 第31-35页 |
| 1.6 体细胞核移植 | 第35-38页 |
| 1.6.1 体细胞核移植技术的发展 | 第35-36页 |
| 1.6.2 体细胞核移植技术的意义 | 第36页 |
| 1.6.3 体细胞核移植效率较低，克隆动物表型异常 | 第36-37页 |
| 1.6.4 DNA甲基化对SCNT的影响 | 第37-38页 |
| 1.6.5 影响SCNT效率低下的其他原因 | 第38页 |
| 1.7 研究目的和意义 | 第38-39页 |
| 2 材料与方法 | 第39-63页 |
| 2.1 本研究技术路线 | 第39页 |
| 2.2 材料 | 第39-45页 |
| 2.2.1 动物及组织样 | 第39页 |
| 2.2.2 细胞 | 第39-40页 |
| 2.2.3 感受态及载体 | 第40-42页 |
| 2.2.4 试剂及试剂盒 | 第42-43页 |
| 2.2.5 主要试剂的配制 | 第43-44页 |
| 2.2.6 主要的仪器及设备 | 第44-45页 |
| 2.3 方法 | 第45-63页 |
| 2.3.1 载体构建 | 第45-54页 |
| 2.3.2 原代成纤维细胞的培养（组织块法） | 第54页 |
| 2.3.3 细胞转染 | 第54-55页 |
| 2.3.4 CRISPR/Cas9对靶位点剪切鉴定 | 第55-56页 |
| 2.3.5 G418筛选阳性单克隆细胞及阳性细胞鉴定 | 第56-57页 |
| 2.3.6 荧光定量PCR | 第57-58页 |
| 2.3.7 Western Blot | 第58-59页 |
| 2.3.8 体外转录 | 第59-61页 |
| 2.3.9 MeDIP-seq | 第61-62页 |
| 2.3.10 RNA-seq测序及数据分析 | 第62页 |
| 2.3.11 高通量数据的提交 | 第62页 |
| 2.3.12 主要分子生物学软件及数据库 | 第62-63页 |
| 3 结果 | 第63-93页 |
| 3.1 猪LTF基因的定点整合 | 第63-72页 |
| 3.1.1 本研究的原理示意图 | 第63-64页 |
| 3.1.2 靶向CSN1S1基因sg RNA的设计及活性鉴定 | 第64-66页 |
| 3.1.3 sgRNA-1 的脱靶分析 | 第66-67页 |
| 3.1.4 同源重组载体的构建 | 第67-68页 |
| 3.1.5 2A短肽的剪切 | 第68-70页 |
| 3.1.6 猪胎儿成纤维细胞的培养 | 第70页 |
| 3.1.7 阳性细胞的筛选 | 第70-72页 |
| 3.1.8 体外转录并用于胚胎注射 | 第72页 |
| 3.2 提高CRISPR/Cas9剪切活性的方法 | 第72-77页 |
| 3.2.1 EGFP-Cas9载体用于富集阳性的突变细胞 | 第72-74页 |
| 3.2.2 稳转EGFP-Cas9 PK15细胞系的建立 | 第74-75页 |
| 3.2.3 多个sgRNA共同靶向一个基因 | 第75-77页 |
| 3.3 截短型sgRNA的活性鉴定与脱靶分析 | 第77-83页 |
| 3.3.1 截短型sgRNA的脱靶分析 | 第77-81页 |
| 3.3.2 截短型sgRNA的脱靶验证 | 第81-83页 |
| 3.4 异常克隆猪的甲基化变化分析 | 第83-93页 |
| 3.4.1 克隆猪的甲基化数据分布 | 第83-86页 |
| 3.4.2 差异甲基化基因分析 | 第86-87页 |
| 3.4.3 差异表达基因分析 | 第87-89页 |
| 3.4.4 差异甲基化和差异表达数据的验证 | 第89-90页 |
| 3.4.5 差异甲基化和差异表达基因的联合分析 | 第90-93页 |
| 4 讨论 | 第93-101页 |
| 4.1 CRISPR/Cas9技术的发展速度 | 第93-94页 |
| 4.2 随机敲入方式获得转基因家畜的缺陷 | 第94页 |
| 4.3 ZFN，TALEN和CRISPR/Cas9三大技术比较 | 第94-95页 |
| 4.4 利用CRISPR/Cas9制备定点转基因猪的可行性 | 第95-97页 |
| 4.5 提高CRISPR/Cas9的效率与降低脱靶的方法 | 第97-98页 |
| 4.6 DNA甲基化的变化影响克隆猪的正常发育 | 第98-101页 |
| 5 小结 | 第101-103页 |
| 5.1 本研究的主要结果与结论 | 第101-102页 |
| 5.2 本研究的创新点与特色 | 第102页 |
| 5.3 本研究不足之处与进一步工作的建议 | 第102-103页 |
| 参考文献 | 第103-130页 |
| 附录 | 第130-136页 |
| 读学位期间撰写论文题录 | 第136-137页 |
| 致谢 | 第137-139页 |
