| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 中英文缩略词 | 第6-10页 |
| 文献综述 | 第10-18页 |
| 1.1 PEDV概述 | 第10-14页 |
| 1.1.1 PEDV基因组结构 | 第10-11页 |
| 1.1.2 PEDV结构蛋白和ORF3蛋白及其功能 | 第11-12页 |
| 1.1.3 PED的流行病学 | 第12-13页 |
| 1.1.4 PEDV致病机制 | 第13-14页 |
| 1.1.5 PEDV免疫病理学 | 第14页 |
| 1.2 PEDV防控研究现状 | 第14-15页 |
| 1.2.1 PEDV疫苗防控 | 第14-15页 |
| 1.2.2 PEDV的药物防控 | 第15页 |
| 1.2.3 生物安全防控措施 | 第15页 |
| 1.3 PEDV诊断方法研究进展 | 第15-18页 |
| 1.3.1 PEDV流行病学诊断 | 第15页 |
| 1.3.2 PEDV临床病理诊断 | 第15-16页 |
| 1.3.3 PEDV病原学诊断 | 第16页 |
| 1.3.4 PEDV血清学诊断 | 第16页 |
| 1.3.5 酶联免疫吸附试验（ELISA） | 第16-17页 |
| 1.3.6 PEDV分子生物学诊断 | 第17-18页 |
| 1 引言 | 第18-19页 |
| 2 材料与方法 | 第19-39页 |
| 2.1 材料 | 第19-22页 |
| 2.1.1 毒株 | 第19页 |
| 2.1.2 质粒及细胞菌株 | 第19-20页 |
| 2.1.3 实验动物 | 第20页 |
| 2.1.4 血清 | 第20页 |
| 2.1.5 主要试剂与仪器 | 第20-21页 |
| 2.1.6 培养基的配制方法 | 第21页 |
| 2.1.7 主要溶液的配制方法 | 第21-22页 |
| 2.2 方法 | 第22-39页 |
| 2.2.1 S417密码子优化及引物设计 | 第22-23页 |
| 2.2.2 目的基因扩增 | 第23-24页 |
| 2.2.3 目的基因连接、转化 | 第24页 |
| 2.2.4 pJET1.2-S417质粒的抽提 | 第24-25页 |
| 2.2.5 原核表达质粒pET32a-S417和pXXGST-S417的构建 | 第25-27页 |
| 2.2.5.1 酶切、连接、转化 | 第25-26页 |
| 2.2.5.2 pET32a-S417和pXXGST-S417质粒的抽提、酶切 | 第26-27页 |
| 2.2.6 pET32a-S417诱导表达 | 第27-29页 |
| 2.2.6.1 pET32a-S417诱导表达条件 | 第27-28页 |
| 2.2.6.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳 | 第28-29页 |
| 2.2.6.3 pET32a-S417-BL21菌体超声破碎及重组蛋白细胞定位分析 | 第29页 |
| 2.2.7 His-S417融合蛋白的过柱纯化 | 第29-31页 |
| 2.2.7.1 镍柱的组装与再生 | 第29页 |
| 2.2.7.2 His-S417融合蛋白的镍柱亲和层析纯化条件优化 | 第29页 |
| 2.2.7.3 His-S417融合蛋白的镍柱亲和层析纯化 | 第29-30页 |
| 2.2.7.4 纯化的His-S417蛋白Western blotting验证 | 第30-31页 |
| 2.2.7.5 纯化后的His-S417融合蛋白透析处理及Western blotting验证 | 第31页 |
| 2.2.7.6 His-S417融合蛋白浓度测定 | 第31页 |
| 2.2.7.7 His-S417融合蛋白浓缩 | 第31页 |
| 2.2.8 pXXGST-S417-BL21诱导表达及纯化 | 第31-33页 |
| 2.2.8.1 pXXGST-S417-BL21诱导表达条件 | 第31-32页 |
| 2.2.8.2 pXXGST-S417-BL21菌体超声破碎及重组蛋白细胞定位分析 | 第32页 |
| 2.2.8.3 GST-S417融合蛋白割胶纯化 | 第32页 |
| 2.2.8.4 纯化的GST-S417蛋白Western blotting验证 | 第32-33页 |
| 2.2.8.5 GST-S417蛋白的浓缩及浓度测定 | 第33页 |
| 2.2.9 PEDV多克隆抗体的制备 | 第33-34页 |
| 2.2.9.1 新西兰大白兔的免疫 | 第33页 |
| 2.2.9.2 兔子三免血清的ELISA检测 | 第33-34页 |
| 2.2.9.3 多克隆抗体的制备收集及Western blotting鉴定 | 第34页 |
| 2.2.9.4 间接ELISA检测多克隆抗体 | 第34页 |
| 2.2.10 间接ELISA方法的初步建立 | 第34-36页 |
| 2.2.10.1 间接ELISA方法步骤 | 第34-35页 |
| 2.2.10.2 间接ELISA方法中抗原最佳包被量、一抗血清最佳稀释比的确定 | 第35页 |
| 2.2.10.3 间接ELISA方法中二抗抗体最佳稀释度的确定 | 第35页 |
| 2.2.10.4 间接ELISA方法中抗原最适包被条件的确定 | 第35页 |
| 2.2.10.5 间接ELISA方法中封闭液的选择 | 第35-36页 |
| 2.2.10.6 间接ELISA方法中阴性临界值的确定 | 第36页 |
| 2.2.10.7 间接ELISA方法中批内重复性试验 | 第36页 |
| 2.2.10.8 间接ELISA方法中批间重复试验 | 第36页 |
| 2.2.10.9 间接ELISA方法的特异性试验及比较试验 | 第36页 |
| 2.2.11 猪流行性腹泻病毒部分S蛋白单克隆抗体的研制 | 第36-39页 |
| 2.2.11.1 BALB/C小鼠的免疫 | 第36-37页 |
| 2.2.11.2 SP2/0 细胞的培养 | 第37页 |
| 2.2.11.3 饲养细胞（小鼠腹腔巨噬细胞）的制备 | 第37页 |
| 2.2.11.4 免疫脾细胞的制备 | 第37页 |
| 2.2.11.5 细胞融合 | 第37页 |
| 2.2.11.6 融合细胞的筛选 | 第37页 |
| 2.2.11.7 杂交瘤细胞亚克隆 | 第37-39页 |
| 3 实验结果 | 第39-52页 |
| 3.1 PEDV S417融合PCR的扩增及克隆载体pJET1.2-S417的构建 | 第39页 |
| 3.2 重组表达载体pET32a-S417、pXXGST-S417的构建 | 第39-40页 |
| 3.3 pET32a-S417-BL2137℃诱导表达可溶性分析及Western blotting验证 | 第40-41页 |
| 3.4 pET32a-S417-BL2118℃诱导表达 | 第41页 |
| 3.5 Ni柱纯化条件的优化及His-S417蛋白 的Western blotting检测 | 第41-43页 |
| 3.6 融合蛋白GST-S417的纯化及Western blotting检测 | 第43页 |
| 3.7 多克隆抗体的制备 | 第43-45页 |
| 3.7.1 三免兔血清的ELISA检测 | 第43-44页 |
| 3.7.2 多克隆抗体的特异性鉴定 | 第44-45页 |
| 3.7.3 多克隆抗体经间接ELISA检测 | 第45页 |
| 3.8 间接ELISA的初步建立 | 第45-49页 |
| 3.8.1 间接ELISA最佳反应条件的确定结果 | 第45-46页 |
| 3.8.2 间接ELISA阴性临界值的确定结果 | 第46-47页 |
| 3.8.3 间接ELISA重复性试验结果 | 第47-48页 |
| 3.8.4 间接ELISA特异性试验与比较试验结果 | 第48-49页 |
| 3.9 单克隆抗体的制备 | 第49-52页 |
| 3.9.1 小鼠免疫结果 | 第49-50页 |
| 3.9.2 细胞融合结果 | 第50-51页 |
| 3.9.3 阳性杂交瘤细胞筛选与亚克隆 | 第51-52页 |
| 4 讨论 | 第52-55页 |
| 4.1 目的基因的选择 | 第52页 |
| 4.2 原核表达载体的选择 | 第52页 |
| 4.3 原核表达条件的优化 | 第52-53页 |
| 4.4 重组蛋白的纯化 | 第53页 |
| 4.5 动物免疫效果的影响因素 | 第53页 |
| 4.6 间接ELISA的影响因素 | 第53-54页 |
| 4.7 影响单克隆抗体制备的因素 | 第54-55页 |
| 5 结论 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-62页 |
| 致谢 | 第62-63页 |
| 附录 | 第63-65页 |
| 附录1 镍柱的组装与再生 | 第63-64页 |
| 附录2 细胞融合操作方法 | 第64-65页 |
| 个人简介 | 第65页 |
| 硕士期间发表的论文 | 第65页 |
