| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-7页 |
| 第一章 引言 | 第10-29页 |
| 1.1 CRISPR/CAs9和PTG技术 | 第10-25页 |
| 1.1.1 CRISPR/Cas9系统的发展及分类 | 第10-13页 |
| 1.1.2 CRISPR/Cas的组成和结构 | 第13-15页 |
| 1.1.3 CRISPR/Cas9系统的作用机制 | 第15-20页 |
| 1.1.4 CRISPR/Cas9系统的应用 | 第20-22页 |
| 1.1.5 CRISPR/Cas9的多位点编辑技术 | 第22-24页 |
| 1.1.6 CRISPR/Cas9与ZFNs和TALENs的比较 | 第24-25页 |
| 1.2 植物组织培养及稳定转化 | 第25-29页 |
| 1.2.1 植物组织培养的发展历程 | 第25-26页 |
| 1.2.2 植物组织遗传转化 | 第26-27页 |
| 1.2.3 植物瞬时表达 | 第27页 |
| 1.2.4 模式植物本氏烟草 | 第27-29页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第29-50页 |
| 2.1 实验材料与试剂 | 第29-34页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第29页 |
| 2.1.2 克隆载体 | 第29-30页 |
| 2.1.3 实验仪器 | 第30-31页 |
| 2.1.4 实验试剂 | 第31-34页 |
| 2.2 实验方法 | 第34-50页 |
| 2.2.1 靶位点的预测,guide序列的设计及克隆 | 第34-36页 |
| 2.2.2 重组子的双元表达载体亚克隆 | 第36页 |
| 2.2.3 利用In-Fusion克隆技术构建编辑载体 | 第36-39页 |
| 2.2.4 PDS基因多个位点编辑的载体克隆 | 第39-43页 |
| 2.2.5 pGREB32重组载体的构建 | 第43页 |
| 2.2.6 感受态细胞的制备 | 第43-44页 |
| 2.2.7 农杆菌介导真空注射法侵染本氏烟草叶片 | 第44-45页 |
| 2.2.8 CTAB法提取烟叶片草基因组DNA | 第45-46页 |
| 2.2.9 基因组RE-PCR | 第46-47页 |
| 2.2.10 基因组PCR-RE | 第47页 |
| 2.2.11 本氏烟草瞬时表达系统中多位点编辑效果的检测 | 第47-48页 |
| 2.2.12 本氏烟草叶圆盘转化 | 第48-50页 |
| 第三章 实验结果与分析 | 第50-71页 |
| 3.1 PDS靶位点GUIDE序列的克隆 | 第50-53页 |
| 3.1.1 PDS基因的靶标位点guide序列的克隆 | 第50-51页 |
| 3.1.2 GFP基因的靶标位点guide序列的克隆 | 第51-53页 |
| 3.2 PCAMBIA-GUIDE双元表达重组载体的构建 | 第53-55页 |
| 3.3 本氏烟草瞬时表达编辑效果的鉴定 | 第55-59页 |
| 3.3.1 PDS基因组DNA-RE PCR鉴定 | 第56-58页 |
| 3.3.2 基因组DNA PCR-RE鉴定 | 第58-59页 |
| 3.4 PTG技术多位点克隆 | 第59-63页 |
| 3.5 PDS基因多位点编辑效果的检测 | 第63-64页 |
| 3.6 本氏烟草再生体系的建立及稳定遗传株系的获得 | 第64-71页 |
| 3.6.1 本氏烟草遗传转化体系的建立 | 第66-71页 |
| 第四章 讨论 | 第71-74页 |
| 4.1 瞬时表达的CRISPR/CAS9系统的编辑效果分析 | 第71-72页 |
| 4.2 CRISPR/CAs9系统在本氏烟草稳定遗传转化的探究 | 第72-74页 |
| 参考文献 | 第74-80页 |
| 附录1 | 第80-82页 |
| 致谢 | 第82-83页 |
| 攻读硕士学位期间取得的成果 | 第83页 |
