| 中文摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-12页 |
| 英文缩略词表 | 第12-13页 |
| 前言 | 第13-14页 |
| 第一章 文献综述 miRNA在致病机制研究中的进展 | 第14-24页 |
| 1. miRNAs概述 | 第14-24页 |
| ·miRNA的发现 | 第15页 |
| ·miRNA的生物特性 | 第15页 |
| ·miRNA的加工过程 | 第15-16页 |
| ·miRNA对靶基因的作用机制 | 第16页 |
| ·miRNA基因的分析方法 | 第16-18页 |
| ·构建富集miRNA的小RNA cDNA文库 | 第16-17页 |
| ·生物信息学方法 | 第17-18页 |
| ·miRNA靶基因预测 | 第18-20页 |
| ·生物信息学方法 | 第18-19页 |
| ·生物学实验方法 | 第19-20页 |
| ·miRNA表达分析方法 | 第20-21页 |
| ·miRNA的功能及应用 | 第21-24页 |
| ·miRNA调控细胞凋亡的研究 | 第21-22页 |
| ·miRNA介导的病毒和宿主的互作 | 第22-24页 |
| 第二章 实验研究 | 第24-60页 |
| 实验一 MDBKCs和BMDBKCs两个样品的小RNA文库构建和Solexa高通量测序 | 第24-36页 |
| 摘要 | 第24-25页 |
| 1 材料和方法 | 第25-31页 |
| ·病毒株、细胞 | 第25页 |
| ·试剂及主要试剂盒 | 第25页 |
| ·引物设计 | 第25页 |
| ·总RNA的提取 | 第25-26页 |
| ·用于测序的总RNA质量检测 | 第26页 |
| ·cDNA文库构建及测序 | 第26-27页 |
| ·小RNA的生物信息学分析 | 第27-28页 |
| ·新miRNA预测 | 第28-29页 |
| ·miRNAs的表达差异分析 | 第29页 |
| ·富含miRNA的总RNA提取和cDNA合成 | 第29-31页 |
| ·富含miRNA的总RNA提取 | 第29-30页 |
| ·cDNA合成 | 第30-31页 |
| ·miRNA的表达差异分析 | 第31页 |
| 2. 结果 | 第31-33页 |
| ·Agilent 2100检测MDBKCs和BMDBKCs总RNA质量 | 第31页 |
| ·小分子RNA的序列信息 | 第31-33页 |
| ·miRNA相关数据信息 | 第33页 |
| ·已知miRNAs表达谱(见附录一) | 第33页 |
| ·新miRNAs表达谱(见附录二) | 第33页 |
| ·两个文库中新miRNAs相关数据信息(见附录三、四、五) | 第33页 |
| ·qRT-PCR验证表达差异显著的miRNA | 第33页 |
| 3 讨论 | 第33-34页 |
| 4. 小结 | 第34-36页 |
| 实验二 双荧光素酶重组表达载体pmirGLO-MAP3K3 3’UTR的构建及鉴定 | 第36-46页 |
| 摘要 | 第36-37页 |
| 1 材料和方法 | 第37-42页 |
| ·材料 | 第37页 |
| ·菌株及载体 | 第37页 |
| ·试剂及主要试剂盒 | 第37页 |
| ·方法 | 第37-40页 |
| ·PCR扩增目的基因 | 第37页 |
| ·回收PCR产物 | 第37-38页 |
| ·目的基因MAP3K3 3’UTR与pMD18-T-simpLe载体连接 | 第38页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第38-39页 |
| ·连接产物的转化 | 第39页 |
| ·重组质粒pMD18-MAP3K3 3’UTR的菌液PCR鉴定 | 第39页 |
| ·重组质粒DNA的提取 | 第39-40页 |
| ·重组质粒pMD18-MAP3K3 3’UTR的酶切鉴定 | 第40页 |
| ·测序 | 第40页 |
| ·双荧光素酶重组表达载体pmirGLO-MAP3K3 3’UTR的构建 | 第40-42页 |
| ·pmirGLO质粒和酶切回收目的基因MAP3K3 3’UTR的双酶切 | 第40页 |
| ·酶切回收目的基因MAP3K3 3’UTR与酶切pmirGLO表达载体的连接 | 第40-41页 |
| ·重组双荧光素酶表达载体pmirGLO-MAP3K3 3’UTR的鉴定及测序 | 第41页 |
| ·测序 | 第41页 |
| ·重组质粒 pmirGLO-MAP3K3 3'UTR DNA 的提取 | 第41-42页 |
| 2 结果 | 第42-43页 |
| ·扩增目的基因MAP3K3 3’UTR | 第42页 |
| ·酶切鉴定重组载体pMD18-MAP3K3 3’UTR | 第42-43页 |
| ·酶切鉴定双荧光素酶重组表达载体pmirGLO-MAP3K3 3’UTR | 第43页 |
| 3. 讨论 | 第43-44页 |
| 4 小结 | 第44-46页 |
| 实验三 miR-33a靶向MAP3K3诱导MDBK细胞产生凋亡 | 第46-60页 |
| 摘要 | 第46-47页 |
| 1 材料和方法 | 第47-51页 |
| ·材料 | 第47-48页 |
| ·病毒株、细胞 | 第47页 |
| ·试剂及主要试剂盒 | 第47页 |
| ·主要仪器 | 第47页 |
| ·引物设计及合成 | 第47-48页 |
| ·方法 | 第48-51页 |
| ·细胞培养及病毒增殖 | 第48页 |
| ·cpBVDV感染MDBK细胞 | 第48页 |
| ·荧光显微镜观察细胞形态变化 | 第48页 |
| ·流式细胞仪检测细胞凋亡率 | 第48页 |
| ·cpBVDV感染的细胞中miR-33a表达水平 | 第48页 |
| ·miR-33a NC和miR-33a mimics转染MDBK细胞 | 第48-49页 |
| ·转染miR-33a NC和miR-33a mimics细胞中miR-33a表达水平 | 第49页 |
| ·TargetScan软件预测miR-33a靶基因 | 第49页 |
| ·miR-33a靶基因验证 | 第49页 |
| ·MAP3K3和BCL-2转录水平检测 | 第49页 |
| ·MAP3K3和BCL-2蛋白水平检测 | 第49-51页 |
| ·转染miR-33a NC和miR-33a mimics的细胞凋亡率检测 | 第51页 |
| 2. 结果 | 第51-57页 |
| ·cpBVDV感染对MDBK细胞形态变化的影响 | 第51-52页 |
| ·流式细胞仪检测细胞凋亡率 | 第52页 |
| ·cpBVDV感染的MDBK细胞中miR-33a的表达水平检测 | 第52-53页 |
| ·miR-33a靶基因预测结果 | 第53页 |
| ·miR-33a靶基因验证结果 | 第53-54页 |
| ·转染miR-33aNC和miR-33a mimics的细胞中miR-33a的相对表达水平 | 第54-55页 |
| ·MAP3K3的转录水平和MAP3K3蛋白水平检测 | 第55-56页 |
| ·BCL-2的转录水平和蛋白水平检测 | 第56-57页 |
| ·流式细胞仪检测细胞的凋亡率 | 第57页 |
| 3. 讨论 | 第57-58页 |
| 4. 小结 | 第58-60页 |
| 参考文献 | 第60-66页 |
| 结论 | 第66-67页 |
| 附录一 BMDBKCs和MDBKCs文库中已知miRNAs表达谱 | 第67-68页 |
| 附录二 BMDBKCs和MDBKCs文库中新miRNAs表达谱 | 第68-69页 |
| 附录三：BMDBKCs文库中新miRNAs相关数据 | 第69-70页 |
| 附录四：MDBKCs文库中新miRNAs的相关数据 | 第70-71页 |
| 附录五 新miRNAs的相关数据 | 第71-72页 |
| 附录六 PmirGLO载体图谱 | 第72-74页 |
| 致谢 | 第74-76页 |
| 作者简介 | 第76-78页 |
| 导师评阅表 | 第78页 |
