| 中文摘要 | 第1-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 综述 | 第13-27页 |
| 1 猪瘟及猪瘟病毒概述 | 第13-14页 |
| 2 猪瘟病毒结构与蛋白功能研究 | 第14-21页 |
| ·猪瘟病毒结构蛋白与功能研究 | 第14-16页 |
| ·猪瘟病毒非结构蛋白与功能研究 | 第16-21页 |
| 3 病毒反向遗传学研究 | 第21页 |
| 4 正链 RNA 病毒复制酶及其复制机制研究 | 第21-22页 |
| 5 猪瘟病毒致病的分子机制研究 | 第22-23页 |
| 6 猪瘟诊断和检测方法 | 第23-25页 |
| 7 猪瘟新型疫苗的研发 | 第25-26页 |
| 8 病毒分节段研究进展 | 第26-27页 |
| 英文缩写一览表 | 第27-29页 |
| 第一部分 PMC18-CSFV-SM-HDV-T7 重组质粒构建与病毒拯救 | 第29-57页 |
| 1 材料 | 第29-34页 |
| ·菌株质粒 | 第29页 |
| ·主要仪器 | 第29-30页 |
| ·实验药品 | 第30-32页 |
| ·溶液配方 | 第32-34页 |
| 2 方法 | 第34-48页 |
| ·PMD18-T-HDV-T7 的构建及鉴定 | 第34-38页 |
| ·引物设计及合成 | 第34-35页 |
| ·PCR 扩增 CSFV 末端片段及 HDV-T7 终止子序列 | 第35页 |
| ·PCR 产物凝胶电泳检测 | 第35-36页 |
| ·PCR 产物纯化回收（Gel/ PCR Extraction Kit） | 第36页 |
| ·CSFV 末端片段与 HDV-T7 终止子序列 overlap PCR 连接 | 第36页 |
| ·HT 与 pMD18-T 连接 | 第36页 |
| ·感受态细胞的制备与保存 | 第36-37页 |
| ·连接产物的转化与质粒提取 | 第37-38页 |
| ·pMD18-T-HT 酶切检测 | 第38页 |
| ·PMC18- CSFV-SM-Q 缺失质粒构建 | 第38-40页 |
| ·CSFV-SM 酶切线性化 | 第39页 |
| ·线性化片段末端平滑化 | 第39页 |
| ·平滑片段环化与鉴定 | 第39-40页 |
| ·PMC18-CSFV-SM-Q-HDV-T7 质粒构建与鉴定 | 第40-42页 |
| ·pMC18-CSFV-SM-Q-HDV-T7 质粒构建 | 第40-41页 |
| ·pMC18-CSFV-SM-Q-HDV-T7 质粒鉴定 | 第41-42页 |
| ·PMC18-CSFV-SM-HDV-T7 重组质粒获得与鉴定 | 第42-44页 |
| ·pMC18-CSFV-SM-HDV-T7 重组质粒获得 | 第42-43页 |
| ·pMC18-CSFV-SM-HDV-T7 重组质粒鉴定 | 第43-44页 |
| ·仓鼠肾细胞 BHK-21 与猪肾细胞 PK-15 培养 | 第44-45页 |
| ·细胞复苏技术 | 第44页 |
| ·细胞传代培养 | 第44页 |
| ·细胞冻存技术 | 第44-45页 |
| ·细胞计数 | 第45页 |
| ·PMC18-CSFV-SM-HDV-T7 重组质粒转染及病毒传代 | 第45-46页 |
| ·pMC18-CSFV-SM-HDV-T7 重组质粒转染 BHK-21 细胞 | 第45-46页 |
| ·病毒传代 | 第46页 |
| ·VCF114-HDV RT-PCR 检测 | 第46-48页 |
| ·病毒 RNA 提取 | 第46页 |
| ·RT-PCR | 第46-48页 |
| ·间接免疫荧光实验 | 第48页 |
| 3 结果 | 第48-56页 |
| ·PMD18-T-HDV-T7 的构建及鉴定 | 第48-50页 |
| ·HT1 HT2 PCR 扩增与连接 | 第48-50页 |
| ·pMD18-T-HDV-T7 重组质粒鉴定 | 第50页 |
| ·PMC18- CSFV-SM-Q 缺失质粒构建与鉴定 | 第50-52页 |
| ·PMC18-CSFV-SM-Q-HDV-T7 质粒构建与鉴定 | 第52-53页 |
| ·PMC18-CSFV-SM-HDV-T7 重组质粒获得与鉴定 | 第53页 |
| ·重组质粒共转染细胞后荧光蛋白的表达 | 第53-54页 |
| ·子代病毒 RT-PCR 检测 | 第54-55页 |
| ·间接免疫荧光检测 | 第55-56页 |
| 4 讨论 | 第56-57页 |
| 第二部分 分节段猪瘟病毒基因组重组质粒构建与病毒拯救 | 第57-74页 |
| 1 材料 | 第57-58页 |
| 2 方法 | 第58-66页 |
| ·PMD18-T-NS5A-3' UTR-HDV-T7 的构建及鉴定 | 第58-60页 |
| ·引物设计及合成 | 第58页 |
| ·PCR 扩增 CSFV NS5A 部分片段和 CSFV 3' UTR-HT | 第58页 |
| ·NS5A 与 3' UTR-HT 片段 overlap PCR 连接及产物纯化 | 第58-59页 |
| ·S-NS5A-3′UTR 与 pMD18-T 连接 | 第59页 |
| ·pMD18-T- S-NS5A-3’UTR-HT 鉴定与提取 | 第59-60页 |
| ·PMC18-T7-5’UTR-ORF-NS5A-3’UTR 重组质粒构建 | 第60-62页 |
| ·pMC18-T7-CSFV-S 重组质粒双酶切 | 第60页 |
| ·乙醇沉淀法回收大片段 | 第60页 |
| ·CSFV NS5A-3’UTR-HT PCR 扩增 | 第60-61页 |
| ·NS5A-3’UTR-HT PCR 产物酶切 | 第61页 |
| ·NS5A-3’UTR-HT 酶切片段与乙醇沉淀法回收大片段连接 | 第61页 |
| ·pMC18-T7-5’UTR-ORF-NS5A-3’UTR-HT 重组质粒的鉴定 | 第61-62页 |
| ·PMD18-T- S-5’UTR -NS5B-3’UTR-HT 重组质粒构建 | 第62-65页 |
| ·引物设计及合成 | 第62-63页 |
| ·PCR 扩增 CSFV-S-5'UTR 与 NS5B-3’UTR-HT 片段 | 第63页 |
| ·CSFV-S-5'UTR 与 CSFV-S-NS5B-3’UTR-HT 连接 | 第63-64页 |
| ·CSFV-S-5'UTR-NS5B-3'UTR-HT 片段与 pMD18-T 连接 | 第64页 |
| ·pMD18-T-CSFV-S-5'UTR-NS5B-3'UTR-HT 重组质粒酶切鉴定 | 第64页 |
| ·pMD18-T-CSFV-S-5'UTR-NS5B-3'UTR 重组质粒测序鉴定 | 第64-65页 |
| ·病毒拯救与检测 | 第65-66页 |
| ·细胞转染与病毒传代 | 第65页 |
| ·子代病毒 RT-PCR | 第65-66页 |
| 3 结果 | 第66-72页 |
| ·PMD18-T-NS5A-3' UTR-HT 的构建及鉴定 | 第66-68页 |
| ·CSFV-S-NS5A 与 CSFV-S-3' UTR-HT PCR 扩增 | 第66-67页 |
| ·NS5A 与 3' UTR-HT 片段 overlap PCR 连接 | 第67页 |
| ·PCR 产物与 T 载体连接测序 | 第67-68页 |
| ·PMC18-T7-5’UTR-ORF-NS5A-3’UTR-HT 重组质粒构建 | 第68-70页 |
| ·pMC18-T7-CSFV-S 重组质粒双酶切 | 第68页 |
| ·NS5A-3' UTR-HT 测序后 PCR 扩增与酶切 | 第68-69页 |
| ·pMC18-T7-5’UTR-ORF-NS5A-3’UTR-HT 重组质粒酶切鉴定 | 第69-70页 |
| ·PMD18-T- S-5’UTR -NS5B-3’UTR-HT 重组质粒构建 | 第70-71页 |
| ·CSFV-S -5'UTR 与 NS5B-3’UTR-HT 扩增与连接 | 第70页 |
| ·pMD18-T- S-5’UTR -NS5B-3’UTR-HT 重组质粒酶切鉴定 | 第70-71页 |
| ·病毒拯救与检测 | 第71-72页 |
| ·子代病毒 RT-PCR 检测 | 第71-72页 |
| 4 讨论 | 第72-74页 |
| 第三部分 结论 | 第74-75页 |
| 附录 | 第75-83页 |
| 附录 4-1：质粒图谱 | 第75页 |
| 附录 4-2：测序结果 | 第75-79页 |
| 附录 4-3：重组质粒构建方案 | 第79-83页 |
| 参考文献 | 第83-89页 |
| 致谢 | 第89-90页 |
| 攻读硕士学位期间发表文章 | 第90页 |
