| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 1 文献综述 | 第11-20页 |
| ·植物中咖啡碱的研究概况 | 第11页 |
| ·咖啡碱对人体的生理作用 | 第11-12页 |
| ·咖啡碱合成代谢途径的研究进展 | 第12-15页 |
| ·咖啡碱的合成前体及其来源 | 第12-13页 |
| ·咖啡碱合成途径中相关酶的研究进展 | 第13-14页 |
| ·山茶科植物中参与咖啡碱合成的甲基转移酶 | 第14-15页 |
| ·茶树中的咖啡碱 | 第15-17页 |
| ·茶树中嘌呤甲基化的研究进展 | 第15-16页 |
| ·茶树中咖啡碱的生物合成部位 | 第16页 |
| ·茶树中咖啡碱的分布规律 | 第16页 |
| ·茶的功效及其与咖啡碱的关系 | 第16-17页 |
| ·降低咖啡碱含量的方法研究进展 | 第17-18页 |
| ·大肠杆菌与酿酒酵母表达系统的研究现状 | 第18-20页 |
| ·大肠杆菌表达系统 | 第18页 |
| ·酿酒酵母表达系统 | 第18-19页 |
| ·酿酒酵母在基因工程上的应用 | 第19-20页 |
| 2 引言 | 第20-24页 |
| ·研究意义 | 第20-21页 |
| ·技术路线 | 第21-23页 |
| ·研究内容 | 第23-24页 |
| ·参与咖啡碱合成途径的关键酶基因在大肠杆菌中的克隆与功能验证 | 第23页 |
| ·酵母中从黄嘌呤核苷到咖啡碱的组合生物合成 | 第23页 |
| ·茶树中候选 7-甲基黄嘌呤核苷水解酶基因的克隆及功能分析 | 第23页 |
| ·茶树咖啡碱合成酶 TCS1 的定点突变与表达差异 | 第23页 |
| ·咖啡碱生物合成关键基因在大肠杆菌中的组合调控 | 第23-24页 |
| 3 材料与方法 | 第24-44页 |
| ·材料 | 第24页 |
| ·仪器与试剂 | 第24-25页 |
| ·主要仪器设备 | 第24页 |
| ·主要试剂盒 | 第24-25页 |
| ·培养基及主要试剂 | 第25页 |
| ·方法 | 第25-44页 |
| ·CaXMT1 和 TCS1 基因的克隆、重组载体构建以及在大肠杆菌中的表达 | 第25-33页 |
| ·总 RNA 的提取 | 第25-26页 |
| ·引物设计 | 第26-27页 |
| ·第链 cDNA 的合成 | 第27页 |
| ·RT-PCR | 第27页 |
| ·凝胶电泳回收纯化 PCR 产物 | 第27-28页 |
| ·PCR 产物和克隆载体的连接 | 第28页 |
| ·感受态细胞转化 | 第28-29页 |
| ·菌落 PCR 筛选阳性克隆 | 第29页 |
| ·质粒提取 | 第29-30页 |
| ·质粒的双酶切反应与重组连接 | 第30页 |
| ·重组质粒的转化 | 第30页 |
| ·目的基因在大肠杆菌中的融合表达 | 第30-31页 |
| ·总蛋白检测 | 第31-32页 |
| ·蛋白可溶性分析 | 第32页 |
| ·CaXMT1 和 TCS1 的体外酶活性检测 | 第32-33页 |
| ·CaXMT1 和 TCS1 基因的克隆、重组载体构建以及在酵母中的整合表达 | 第33-36页 |
| ·目的基因的人工合成 | 第33页 |
| ·Gateway 技术简介 | 第33页 |
| ·目的基因的入门克隆 | 第33-34页 |
| ·LR 重组装入酵母表达载体 | 第34页 |
| ·酵母感受态细胞 INVSC1 的制备（化学法） | 第34-35页 |
| ·酵母感受态细胞的转化 | 第35页 |
| ·目的基因在酵母中的整合表达与蛋白诱导 | 第35页 |
| ·酶活性检测与分析 | 第35-36页 |
| ·茶树中候选 7-甲基黄嘌呤核苷水解酶基因（7-MX Nucleosidase）的克隆及功能验证 | 第36-41页 |
| ·候选核苷酶基因的筛选 | 第36页 |
| ·在茶树不同器官中的基因差异表达情况 | 第36-37页 |
| ·候选核苷酶基因的 5’RACE 扩增 | 第37-40页 |
| ·候选核苷酶基因的入门克隆 | 第40页 |
| ·候选核苷酶基因与 CaXMT1 基因在酵母中的整合表达与功能分析 | 第40-41页 |
| ·候选核苷酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达与功能分析 | 第41页 |
| ·茶树中咖啡酶合成基因（TCS1）的定点突变及体外酶活性的比较.31 | 第41-44页 |
| ·设计突变位点 | 第41页 |
| ·TAKARA 定点突变试剂盒（MutanBEST）原理 | 第41-42页 |
| ·突变 PCR 反应 | 第42-43页 |
| ·TCS1 与突变体的体外酶活性的差异比较 | 第43-44页 |
| 4 结果与分析 | 第44-60页 |
| ·参与咖啡碱合成的甲基转移酶 CaXMT1 和 TCS1 在大肠杆菌中的表达 | 第44-47页 |
| ·RNA 提取与质量检测 | 第44页 |
| ·PCR 扩增产物检测 | 第44-45页 |
| ·目的片段与表达载体的连接 | 第45-46页 |
| ·融合蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第46页 |
| ·融合蛋白的体外酶活性检测 | 第46-47页 |
| ·甲基转移酶 CaXMT1 和 TCS1 在酵母中的整合表达及功能分析 | 第47-49页 |
| ·CaXMT1 与 TCS1 基因的入门克隆、与酵母表达载体的连接 | 第47页 |
| ·CaXMT1 在酵母产物中的功能验证 | 第47-48页 |
| ·酵母产物中咖啡碱的检测 | 第48-49页 |
| ·候选核糖核苷水解酶与甲基转移酶在酵母中的共表达 | 第49-54页 |
| ·核苷酶目标基因的筛选与扩增 | 第49-50页 |
| ·RACE 技术扩增候选核苷酶基因的 5'端 | 第50-52页 |
| ·候选核苷酶基因的 ORF 序列的扩增 | 第52页 |
| ·候选核苷酶基因的入门克隆、与酵母表达载体的连接 | 第52页 |
| ·核苷酶 STx 与 CaXMT 基因在酵母中的共表达及功能分析 | 第52-53页 |
| ·候选核苷酶 STx 在大肠杆菌中的单独表达及功能分析 | 第53-54页 |
| ·茶树咖啡碱合成酶基因 TCS1 的定点突变与体外功能活性研究 | 第54-58页 |
| ·TCS1 基因的突变位点设计 | 第54页 |
| ·突变体的 PCR 扩增 | 第54-55页 |
| ·突变基因的突变位点验证 | 第55页 |
| ·突变基因的表达 | 第55-56页 |
| ·突变基因的酶活性检测 | 第56-58页 |
| ·甲基转移酶 CaXMT1 和 TCS1 在大肠杆菌中的整合表达 | 第58-60页 |
| ·CaXMT1 和 TCS1 基因在大肠杆菌中的整合 | 第58页 |
| ·两个基因在大肠杆菌共表达后的体外酶活性的检测 | 第58页 |
| ·两个基因在大肠杆菌共表达后的体内功能活性分析 | 第58-60页 |
| 5 结论与讨论 | 第60-62页 |
| ·甲基转移酶 CaXMT1 和 TCS1 分别在大肠杆菌中的表达 | 第60页 |
| ·CaXMT1 和 TCS1 在酵母中的整合表达 | 第60页 |
| ·候选核糖核苷酶的筛选、表达及功能分析 | 第60-61页 |
| ·TCS1 的定点突变 | 第61页 |
| ·CaXMT1 和 TCS1 在大肠杆菌中的整合表达 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-67页 |
| 附录 A. 英文缩写及注释 | 第67-68页 |
| 附录 B. CaXMT1 与 TCS1 基因 ORF 核苷酸序列 | 第68-69页 |
| 附录 C. 茶树候选核苷酶 STx 及内参基因的核苷酸序列 | 第69-71页 |
| 附录 D. TCS1 的突变体 TMx 的测序结果 | 第71-73页 |
| 致谢 | 第73-74页 |
| 作者简介 | 第74页 |
