| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 目录 | 第8-11页 |
| 1 前言 | 第11-32页 |
| ·天然橡胶生物合成的分子机制研究进展 | 第11-14页 |
| ·天然橡胶生物合成前体IPP和DMAPP的生成途径 | 第11-12页 |
| ·天然橡胶生物合成的MVA途径 | 第12-14页 |
| ·天然橡胶生物合成的激素调节 | 第14-17页 |
| ·乙烯对天然橡胶生物合成调节的研究进展 | 第14-16页 |
| ·茉莉酸在天然橡胶生物合成中的作用 | 第16-17页 |
| ·cis-prenyltransferases(顺式-异戊烯基转移酶)的研究进展 | 第17-19页 |
| ·cis-prenyltransferase在植物中的研究进展 | 第17-18页 |
| ·cis-prenyltransferase在橡胶树中的研究进展 | 第18-19页 |
| ·植物启动子及其应用的研究进展 | 第19-24页 |
| ·植物启动子的基本特点 | 第19-21页 |
| ·转录起始位点的特点 | 第19页 |
| ·TATA-box | 第19-20页 |
| ·CAAT-box | 第20页 |
| ·GC-box | 第20页 |
| ·特殊的上游顺式作用元件 | 第20-21页 |
| ·植物启动子的转录模式 | 第21-22页 |
| ·组成型启动子 | 第21页 |
| ·组织特异性启动子 | 第21-22页 |
| ·诱导型启动子 | 第22页 |
| ·启动子的克隆方法 | 第22-24页 |
| ·利用启动子探针载体筛选启动子 | 第22页 |
| ·利用常规PCR技术克隆启动子 | 第22页 |
| ·环状PCR | 第22-23页 |
| ·YADE法 | 第23页 |
| ·热不对称交错式PCR(TAIL-PCR) | 第23-24页 |
| ·转录因子 | 第24-25页 |
| ·转录因子的结构 | 第24-25页 |
| ·转录因子的分类 | 第25页 |
| ·转录因子的调控 | 第25页 |
| ·酵母单杂交技术的研究进展 | 第25-30页 |
| ·酵母单杂交技术的原理与优点 | 第25-27页 |
| ·酵母单杂交技术的基本原理 | 第25-27页 |
| ·酵母单杂交技术的优缺点 | 第27页 |
| ·酵母单杂交技术的应用 | 第27-30页 |
| ·转录因子基因的克隆 | 第27-29页 |
| ·确定已知DNA-蛋白质的相互作用 | 第29-30页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第30-31页 |
| ·本研究的技术路线 | 第31-32页 |
| 2 材料与方法 | 第32-53页 |
| ·材料与试剂 | 第32-33页 |
| ·植物材料 | 第32页 |
| ·质粒及菌种 | 第32页 |
| ·试剂 | 第32-33页 |
| ·方法与步骤 | 第33-53页 |
| 第一部分 酵母单杂交诱饵载体的构建与3-AT的工作浓度筛选 | 第33-42页 |
| ·酵母单杂交技术的文库构建及阳性筛选的策略 | 第33页 |
| ·橡胶转移酶基因HRT的启动子的克隆 | 第33-34页 |
| ·橡胶树基因组DNA的提取 | 第33-34页 |
| ·Genome Walker文库构建及Genome Walker DNA Walking | 第34-38页 |
| ·引物的设计及合成 | 第34页 |
| ·Genome Walker文库构建及Genome Walker DNA Walking | 第34-35页 |
| ·PCR产物的回收 | 第35-36页 |
| ·PCR目的片段的克隆及其重组子的筛选 | 第36-38页 |
| ·连接反应 | 第36页 |
| ·感受态E.coli DH5α的制备 | 第36页 |
| ·感受态的鉴定 | 第36-37页 |
| ·转化 | 第37页 |
| ·质粒DNA的提取 | 第37-38页 |
| ·重组子的酶切鉴定 | 第38页 |
| ·重组子菌种的保存 | 第38页 |
| ·HbRT基因启动子的诱饵载体的构建 | 第38-40页 |
| ·引物设计与合成 | 第38-39页 |
| ·HbRT基因启动子的诱饵载体(pHis2.1-pHbRT)的构建与鉴定 | 第39-40页 |
| ·重组质粒pMD18-T-pHbRT的构建及鉴定 | 第39页 |
| ·转化 | 第39页 |
| ·质粒DNA的提取 | 第39页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第39页 |
| ·重组质粒菌种的保存 | 第39页 |
| ·HbRT基因启动子(pHbRT))的酶切 | 第39页 |
| ·酵母单杂交诱饵载体pHis2.1的酶切 | 第39-40页 |
| ·目的片段与表达载体的连接 | 第40页 |
| ·转化 | 第40页 |
| ·质粒DNA的提取 | 第40页 |
| ·重组子的筛选鉴定 | 第40页 |
| ·重组子菌种的保存 | 第40页 |
| ·酵母单杂交诱饵载体pHis2.1-pHbRT的检测 | 第40-42页 |
| ·酵母菌株Y187表型的鉴定 | 第40页 |
| ·酵母单杂交阴阳性对照实验 | 第40-42页 |
| ·酵母感受态细胞的制备 | 第41页 |
| ·酵母单杂交阴阳性对照实验 | 第41-42页 |
| ·诱饵载体pHis2.1-pHbRT的3-AT浓度的筛选 | 第42页 |
| 第二部分 酵母单杂交的胶乳cDNA文库的构建 | 第42-47页 |
| ·胶乳总RNA的提取和mRNA的分离、纯化 | 第43-45页 |
| ·橡胶树胶乳总RNA的提取 | 第43页 |
| ·RNA电泳检测 | 第43-44页 |
| ·橡胶树胶乳mRNA的分离与纯化 | 第44-45页 |
| ·cDNA的合成 | 第45-47页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第45-46页 |
| ·cDNA第二链的合成 | 第46-47页 |
| ·双链cDNA的纯化 | 第47页 |
| 第三部分 诱饵载体与cDNA文库质粒的大规模杂交筛选 | 第47-53页 |
| ·诱饵载体和cDNA文库质粒的大规模杂交 | 第48-49页 |
| ·文库载体pGADT7-Rec2的线性化 | 第48页 |
| ·配制下列琼脂平板 | 第48页 |
| ·制备酵母感受态细胞 | 第48页 |
| ·诱饵载体和cDNA文库质粒大规模地向酵母共转化 | 第48-49页 |
| ·阳性克隆的确定与互作分析 | 第49-51页 |
| ·酵母菌落PCR初步确定阳性克隆 | 第49页 |
| ·文库质粒的分离与鉴定 | 第49-50页 |
| ·酵母质粒的提取 | 第49-50页 |
| ·酵母质粒电击转化大肠杆菌 | 第50页 |
| ·文库质粒的分离及分析 | 第50页 |
| ·阳性克隆的复筛 | 第50-51页 |
| ·筛选出的转录因子RT-PCR表达分析 | 第51-53页 |
| ·材料的处理 | 第51页 |
| ·各激素的施用方法 | 第51页 |
| ·采样方法 | 第51页 |
| ·RNA的提取 | 第51页 |
| ·cDNA的合成 | 第51页 |
| ·Actin基因指数增长期的确定 | 第51-52页 |
| ·方法同3.2 | 第52页 |
| ·RT-PCR分析 | 第52-53页 |
| 3 结果与分析 | 第53-72页 |
| ·Genomewalker文库的构建与Genomewalker DNA Walking | 第53-54页 |
| ·橡胶转移酶基因启动子的序列分析 | 第54-57页 |
| ·酵母单杂诱饵载体的构建及验证 | 第57-59页 |
| ·诱饵载体的构建 | 第57页 |
| ·诱饵载体pHis2.1-pHbRT的3-AT浓度的筛选 | 第57-59页 |
| ·cDNA文库的构建 | 第59-60页 |
| ·橡胶树胶乳总RNA的提取 | 第59页 |
| ·cDNA双链的合成 | 第59-60页 |
| ·酵母单杂交筛选胶乳cDNA文库及阳性克隆的筛选 | 第60-64页 |
| ·诱饵载体和cDNA文库质粒共转化酵母 | 第60-61页 |
| ·阳性克隆的初步筛选 | 第61-62页 |
| ·分离cDNA文库质粒 | 第62页 |
| ·阳性克隆的复筛选(转录因子活性的验证) | 第62-64页 |
| ·阳性克隆的T7测序和生物信息学分析 | 第64-70页 |
| ·HbRZ,HbEIN,HbMYC的表达分析 | 第70-72页 |
| ·HbRZ,HbEIN,HbMYC的组织特异性表达 | 第70页 |
| ·激素处理对HbRZ,HbEIN,HbMYC,HbRT1,HbRT2的表达影响 | 第70-72页 |
| 4 讨论 | 第72-78页 |
| ·橡胶转移酶基因的5’调控序列分析 | 第72页 |
| ·HbRZ、HbEIN和HbMYC转录因子的调控分析 | 第72-74页 |
| ·HbRZ、HbEIN和HbMYC转录因子结构域的分析 | 第74-75页 |
| ·HbRZ转录因子结构域的分析 | 第74页 |
| ·HbEIN转录因子结构域的分析 | 第74-75页 |
| ·HbMYC转录因子结构域的分析 | 第75页 |
| ·转录因子的研究方法 | 第75-76页 |
| ·酵母单杂交的假阳性问题 | 第76-78页 |
| 5 结论 | 第78-80页 |
| 参考文献 | 第80-86页 |
| 附录 有关试剂的配制 | 第86-90页 |
| 致谢 | 第90页 |
