| 中文摘要 | 第1-13页 |
| Abstract | 第13-16页 |
| 1 前言 | 第16-29页 |
| ·基因沉默 | 第16-18页 |
| ·转录后基因沉默在生物界的广泛性 | 第16-17页 |
| ·转录后基因沉默的可传导性 | 第17-18页 |
| ·转录后基因沉默的高特异性 | 第18页 |
| ·RNA 沉默涉及到的主要因子 | 第18-20页 |
| ·dsRNA 和 siRNA | 第18-19页 |
| ·双链 RNA 特异性核酸内切酶（Dicer） | 第19-20页 |
| ·RNA 介导的病毒抗性 | 第20-24页 |
| ·RNA 介导病毒抗性的特点 | 第21-22页 |
| ·RNA 介导的病毒抗性属于转录后基因沉默 | 第22页 |
| ·RNA 沉默是生物体抵抗病毒的防御机制 | 第22-23页 |
| ·hpRNA 与 RNA 介导的病毒抗性 | 第23-24页 |
| ·高效 hpRNA 表达载体的构建 | 第24-25页 |
| ·hpRNA 茎结构长度的影响 | 第24-25页 |
| ·hpRNA 环区域的影响 | 第25页 |
| ·RNA 介导的病毒抗性抗多种病毒的研究 | 第25-26页 |
| ·原核表达 dsRNA 抗病毒的研究 | 第26-28页 |
| ·本研究的目的及其意义 | 第28-29页 |
| 2 材料与方法 | 第29-51页 |
| ·材料 | 第29页 |
| ·毒源 | 第29页 |
| ·供试植物 | 第29页 |
| ·菌株 | 第29页 |
| ·酶与各种生化试剂 | 第29页 |
| ·方法 | 第29-51页 |
| ·构建原核表达载体 | 第29-33页 |
| ·原核表达载体的构建策略 | 第29-30页 |
| ·以 pGEM-CP600 的构建过程为例： | 第30-31页 |
| ·PCR 扩增特异性引物 | 第31-33页 |
| ·PCR 扩增目的片段 | 第33-34页 |
| ·目的片段与克隆载体的连接 | 第34页 |
| ·目的片段和质粒 DNA 的酶切 | 第34页 |
| ·DNA 片段的回收（试剂盒法） | 第34-35页 |
| ·目的片段与质粒 DNA 的连接 | 第35页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第35-36页 |
| ·质粒 DNA 向大肠杆菌中转化（热激法） | 第36页 |
| ·质粒向大肠杆菌中的转化（电击法） | 第36-37页 |
| ·转化菌落 PCR 鉴定 | 第37页 |
| ·质粒 DNA 的大量提取（碱性 SDS 法） | 第37-39页 |
| ·质粒的提取（TIANprep Mini Plasmid Kit 质粒小提试剂盒提取） | 第39-40页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第40-41页 |
| ·dsRNA 的表达、提取和分析 | 第41-43页 |
| ·dsRNA 的诱导表达 | 第41页 |
| ·Trizol 法提取 dsRNA | 第41页 |
| ·高压破碎仪获得大量 dsRNA | 第41-42页 |
| ·意大利 GEA Niro Soavi 公司 NS1001L 型高压细胞破碎仪操作使用说明 | 第42-43页 |
| ·dsRNA 介导的病毒抗性鉴定 | 第43页 |
| ·供试植株的 ELISA 检测 | 第43-44页 |
| ·Northern 杂交分析 | 第44-48页 |
| ·供试植株总 RNA 的提取（Trizol 一步提取法） | 第44页 |
| ·在含有甲醛的凝胶上进行 RNA 电泳 | 第44-45页 |
| ·转膜 | 第45页 |
| ·探针制备 | 第45-46页 |
| ·DIG 标记有效性检测 | 第46-47页 |
| ·杂交 | 第47-48页 |
| ·siRNA 的提取和杂交 | 第48-51页 |
| ·siRNA 提取步骤（PurelinkTM miRNA isolation Kit 提取） | 第48-49页 |
| ·siRNA 的采用 PAGE 电泳 | 第49-50页 |
| ·转膜 | 第50页 |
| ·siRNA 杂交和检测 | 第50-51页 |
| 3 结果与分析 | 第51-74页 |
| ·原核表达 PVY 基因组不同功能基因的 dsRNA 抗病毒研究 | 第51-59页 |
| ·hpRNA 原核表达载体的构建 | 第51-55页 |
| ·PCR 扩增 hpRNA 中“环”的片段 | 第51页 |
| ·GUS 片段与目的载体 pGEM 的连接 | 第51-52页 |
| ·PVY 不同功能基因正向和反向目的片段的获得 | 第52-53页 |
| ·正向目的片段与目的载体 pGEM-GUS 的连接 | 第53页 |
| ·反向目的片段与重组中间载体的连接 | 第53-55页 |
| ·转化大肠杆菌 M-JM109lacY 菌株 | 第55页 |
| ·dsRNA 的诱导表达和提取 | 第55-56页 |
| ·原核表达的 dsRNA 介导的病毒抗性检测 | 第56-57页 |
| ·供试烟草的 ELISA 检测 | 第57页 |
| ·供试烟草植株的 Northern 杂交分析 | 第57-58页 |
| ·供试烟草植株中 siRNA 的杂交分析 | 第58-59页 |
| ·原核表达 PVY NIb 基因不同区段的 dsRNA 的抗病毒研究 | 第59-65页 |
| ·hpRNA 原核表达载体的构建 | 第59-62页 |
| ·hpRNA 中环的构建同 3.1.1.1 和 3.1.1.2 | 第59页 |
| ·PVY NIb 基因不同区段正向和反向目的片段的获得 | 第59页 |
| ·正向目的片段与目的载体 pGEM-GUS 的连接 | 第59-60页 |
| ·反向目的片段与重组中间载体的连接 | 第60-61页 |
| ·转化大肠杆菌 M-JM109lacY 菌株 | 第61-62页 |
| ·dsRNA 的诱导表达和提取 | 第62页 |
| ·原核表达的 dsRNA 介导的病毒抗性检测 | 第62-63页 |
| ·供试烟草的 ELISA 检测 | 第63-64页 |
| ·供试烟草植株的 Northern 杂交分析 | 第64-65页 |
| ·供试烟草植株中 siRNA 的杂交分析 | 第65页 |
| ·原核表达 PVY、TMV 的 dsRNA 多抗病毒研究 | 第65-74页 |
| ·hpRNA 原核表达载体的构建 | 第65-69页 |
| ·hpRNA 中环的构建同 3.1.1.1 和 3.1.1.2 | 第66页 |
| ·hpRNA 中正向和反向目的片段的获得 | 第66-67页 |
| ·正向目的片段与目的载体 pGEM-GUS 的连接 | 第67页 |
| ·反向目的片段与重组中间载体的连接 | 第67-69页 |
| ·转化大肠杆菌 M-JM109lacY 菌株 | 第69页 |
| ·dsRNA 的诱导表达和提取 | 第69-70页 |
| ·原核表达的 PVY、TMV dsRNA 介导的病毒抗性检测 | 第70-71页 |
| ·供试烟草的 ELISA 检测 | 第71-72页 |
| ·供试烟草植株中 siRNA 的杂交分析 | 第72-74页 |
| 4 讨论 | 第74-78页 |
| 5 结论 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-88页 |
| 致谢 | 第88-89页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第89页 |
