| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 1 前言 | 第9-40页 |
| ·南极、深海生态学研究简介 | 第9-12页 |
| ·南极概况 | 第9页 |
| ·深海环境简介 | 第9-10页 |
| ·南极微生物学研究进展 | 第10-11页 |
| ·南极普里兹湾生态环境研究进展 | 第11-12页 |
| ·极端生物和极端酶 | 第12-17页 |
| ·低温微生物 | 第14页 |
| ·嗜热微生物 | 第14-15页 |
| ·嗜酸、嗜碱微生物 | 第15-16页 |
| ·嗜盐微生物 | 第16页 |
| ·其他极端微生物 | 第16-17页 |
| ·低温微生物和低温酶 | 第17-19页 |
| ·低温微生物的生态分布 | 第18页 |
| ·低温微生物和低温酶的应用及前景 | 第18-19页 |
| ·微生物淀粉酶研究简介 | 第19-22页 |
| ·微生物α-淀粉酶 | 第19-20页 |
| ·α—淀粉酶分子生物学 | 第20-21页 |
| ·原生质体融合和诱变 | 第21页 |
| ·基因克隆及氨基酸序列 | 第21页 |
| ·淀粉酶的生产 | 第21-22页 |
| ·α-淀粉酶纯化和酶的特性 | 第22页 |
| ·微生物脂肪酶的研究进展 | 第22-28页 |
| ·微生物脂肪酶的研究进展 | 第23-24页 |
| ·微生物脂肪酶及其筛选方法 | 第24-25页 |
| ·微生物脂肪酶的发酵生产 | 第25页 |
| ·微生物脂肪酶在食品工业中的应用 | 第25-28页 |
| ·油脂的改性 | 第25-26页 |
| ·脂肪酶在乳制品中的应用 | 第26页 |
| ·脂肪酶在面类食品加工中的应用 | 第26-27页 |
| ·脂肪酶在其他食品工业中的应用 | 第27页 |
| ·其他应用 | 第27-28页 |
| ·微生物酶的发酵和产量的提高 | 第28-30页 |
| ·培养基 | 第28-29页 |
| ·产酶微生物的要求 | 第29页 |
| ·发酵生产 | 第29-30页 |
| ·酶的纯化 | 第30-31页 |
| ·克隆与低温酶的大量表达 | 第31-32页 |
| ·蛋白质工程:稳定性和催化能力的提高 | 第32-33页 |
| ·酶的定点突变 | 第33页 |
| ·酯酶和脂肪酶的高通量筛选方法(High Through—put Screening,HTS) | 第33-34页 |
| ·新型酶的发现 | 第34-35页 |
| ·分子生物学技术在微生物多样性和生物活性物质研究中的应用 | 第35-38页 |
| ·从自然样品中直接提取核酸 | 第35-36页 |
| ·聚合酶链式反应法(PCR) | 第36页 |
| ·克隆基因文库分析法 | 第36-37页 |
| ·宏基因组文库构建 | 第37页 |
| ·宏基因组文库的筛选 | 第37-38页 |
| ·本论文研究的目的与意义 | 第38-40页 |
| 2 材料与方法 | 第40-76页 |
| ·材料 | 第40-50页 |
| ·样品采集与前处理 | 第40页 |
| ·菌株和质粒 | 第40页 |
| ·引物 | 第40-44页 |
| ·工具酶 | 第44页 |
| ·其他试剂 | 第44-45页 |
| ·常用溶液、培养基的配制 | 第45-49页 |
| ·主要仪器 | 第49-50页 |
| ·主要分析软件 | 第50页 |
| ·方法 | 第50-76页 |
| ·基本方法 | 第50-65页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第50-51页 |
| ·质粒的转化 | 第51页 |
| ·质粒提取 | 第51-52页 |
| ·酶切反应 | 第52页 |
| ·从凝胶上回收DNA | 第52页 |
| ·DNA沉淀 | 第52页 |
| ·细菌染色体DNA的提取 | 第52-53页 |
| ·沉积物中总DNA的提取与纯化 | 第53页 |
| ·沉积物中粗提DNA的纯化 | 第53页 |
| ·双链DNA补齐与磷酸化 | 第53-54页 |
| ·质粒去磷酸化 | 第54页 |
| ·连接反应 | 第54页 |
| ·(化学转化)感受态细胞的制备 | 第54页 |
| ·质粒的化学转化 | 第54-55页 |
| ·PCR反应 | 第55页 |
| ·菌落PCR | 第55-56页 |
| ·蛋白质透析除盐及浓缩 | 第56页 |
| ·碱性淀粉酶、脂肪酶的分离纯化 | 第56-57页 |
| ·硫酸铵分级沉淀预实验 | 第56页 |
| ·硫酸铵沉淀 | 第56页 |
| ·脱盐 | 第56-57页 |
| ·离子交换层析中溶液pH值的选择 | 第57页 |
| ·离子交换层析 | 第57页 |
| ·分子筛层析 | 第57页 |
| ·重组淀粉酶、脂肪酶的诱导表达及纯化 | 第57-58页 |
| ·蛋白质浓度的测定 | 第58页 |
| ·SDS-PAGE | 第58-59页 |
| ·氢氧化钠直接滴定法测定脂肪酶活力 | 第59页 |
| ·pNPP法测定脂肪酶活力 | 第59-60页 |
| ·SKB法测定淀粉酶活力 | 第60-61页 |
| ·α-淀粉酶活测定 | 第61-62页 |
| ·DNS法测定淀粉酶活力 | 第62-64页 |
| ·淀粉酶酶谱分析(活性染色) | 第64页 |
| ·薄层层析分析酶解产物 | 第64-65页 |
| ·核酸测序及序列分析 | 第65页 |
| ·16Sr DNA的鉴定与系统发育树的构建 | 第65页 |
| ·普里兹湾深海沉积物淀粉酶和脂肪酶等水解酶类多样性分析 | 第65-66页 |
| ·样品的采集和前处理 | 第65页 |
| ·菌种分离和筛选 | 第65页 |
| ·菌种鉴定(BIOLOG Micro Station) | 第65-66页 |
| ·细菌的DAPI和AO双染色计数 | 第66页 |
| ·南极低温淀粉酶产生菌的分类鉴定及其发酵条件和酶学性质研究 | 第66-70页 |
| ·培养基及培养方法 | 第66-67页 |
| ·菌种分离与鉴定 | 第67页 |
| ·温度对菌株7197生长的影响 | 第67页 |
| ·发酵条件研究 | 第67-68页 |
| ·粗酶液制备及初步纯化 | 第68页 |
| ·淀粉酶酶活测定 | 第68-69页 |
| ·脂肪酶酶活测定 | 第69页 |
| ·酶的基本特征 | 第69-70页 |
| ·7197淀粉酶基因的克隆及测序 | 第70-71页 |
| ·第一轮简并引物PCR反应 | 第70页 |
| ·第二轮巢式PCR反应 | 第70页 |
| ·第三轮再做引物PCR反应 | 第70-71页 |
| ·第四轮PCR扩增全长基因amyP重组表达载体并测序 | 第71页 |
| ·7323脂肪酶基因的克隆及测序、表达载体构建 | 第71-73页 |
| ·pT-16srDNA载体构建 | 第71页 |
| ·脂肪酶lipA基因的PCR扩增和pT-lipA质粒的构建 | 第71-72页 |
| ·重组表达载体pLLP-OmpA-lipA的构建 | 第72页 |
| ·脂肪酶LipA的诱导表达与纯化 | 第72-73页 |
| ·脂肪酶LipA的诱导表达 | 第72页 |
| ·非变性条件下表达酶LipA的纯化 | 第72-73页 |
| ·南极普里兹湾深海沉积物宏基因组DNA低温脂肪酶的PCR克隆 | 第73-76页 |
| ·样品的采集和前处理 | 第73页 |
| ·沉积物总DNA的提取 | 第73页 |
| ·脂肪酶基因的PCR克隆 | 第73-74页 |
| ·表达载体的构建pLLP-lip3的构建 | 第74页 |
| ·脂肪酶的诱导表达 | 第74页 |
| ·脂肪酶的纯化 | 第74-75页 |
| ·脂肪酶酶活力测定 | 第75页 |
| ·温度对酶活力及稳定性的影响测定 | 第75页 |
| ·pH值对酶活力及稳定性的影响 | 第75页 |
| ·温度对酶促反应的影响 | 第75页 |
| ·核酸测序及同源性分析 | 第75-76页 |
| 3 结果与讨论 | 第76-117页 |
| ·南极普里兹湾深海(PN5-6)站位微生物淀粉酶的多样性调查 | 第76-80页 |
| ·深海沉积物中微生物的分离 | 第76页 |
| ·低温淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶等产生菌的筛选 | 第76页 |
| ·PN5-6沉积物中细菌多样性分布及系统发育分析 | 第76-78页 |
| ·低温淀粉酶产生菌的生理鉴定 | 第78-79页 |
| ·高淀粉酶活性菌株7193和7197的酶谱分析 | 第79-80页 |
| ·7197淀粉酶产生菌的研究 | 第80-92页 |
| ·深海沉积物中产淀粉酶菌株7197的分离鉴定 | 第80-81页 |
| ·7197菌株的形态特征 | 第81-82页 |
| ·7197菌株的生理生化特性 | 第82页 |
| ·7197菌株16S rDNA序列分析结果 | 第82-83页 |
| ·7197菌株系统发育分析 | 第83-84页 |
| ·产酶培养基的优化 | 第84-85页 |
| ·不同的有机碳源对产酶的影响 | 第84页 |
| ·不同的氮源对产酶的影响 | 第84-85页 |
| ·不同无机盐对产酶的影响 | 第85页 |
| ·发酵条件的优化 | 第85-87页 |
| ·培养温度对产酶的影响 | 第86页 |
| ·培养时间对产酶的影响 | 第86页 |
| ·接种量对产酶的影响 | 第86页 |
| ·起始pH值对产酶的影响 | 第86-87页 |
| ·产酶条件试验 | 第87页 |
| ·低温脂肪酶和淀粉酶的分离纯化 | 第87-88页 |
| ·低温复合酶的酶学性质研究 | 第88-91页 |
| ·温度对复合酶活性的影响 | 第88-89页 |
| ·复合酶的热稳定性 | 第89-90页 |
| ·pH对脂肪酶活性的影响 | 第90页 |
| ·表面活性剂对脂肪酶活力的影响 | 第90页 |
| ·金属离子及螯合剂对脂肪酶活力的影响 | 第90-91页 |
| ·讨论 | 第91-92页 |
| ·Pseudomonas sp.7197淀粉酶基因的克隆和表达 | 第92-100页 |
| ·Pseudomonas sp.7197基因组DNA的提取 | 第92页 |
| ·Pseudomonas sp.7197淀粉酶基因的克隆和测序 | 第92-95页 |
| ·Pseudomonas sp.7197淀粉酶基因的保守区域的克隆和测序 | 第92-93页 |
| ·巢式PCR克隆7197淀粉酶保守区域两段的序列 | 第93-94页 |
| ·Pseudomonas sp.7197淀粉酶各片段基因克隆结果分析 | 第94页 |
| ·Pseudomonas sp.7197淀粉酶基因全长的克隆和测序 | 第94-95页 |
| ·序列同源比对分析 | 第95-97页 |
| ·Pseudomonas sp.7197淀粉酶amyP基因重组表达载体的构建和表达 | 第97-98页 |
| ·纯酶性质:纯化AmyP的最适温度曲线 | 第98-99页 |
| ·薄层层析(TLC)分析酶解产物 | 第99-100页 |
| ·Pseudomonas sp.7323脂肪酶基因lipA的克隆和表达 | 第100-109页 |
| ·Pseudomonas sp.7323脂肪酶基因lipA全长的克隆 | 第100页 |
| ·氨基序列分析和结构预测 | 第100-103页 |
| ·Pseudomonas sp.7323脂肪酶lipA基因重组表达载体的构建和表达 | 第103-104页 |
| ·纯化的表达型rLipA和野生型wLipA的最适作用温度和pH | 第104-105页 |
| ·金属离子及螯合剂对脂肪酶活力的影响 | 第105-106页 |
| ·表面活性剂对脂肪酶活力的影响 | 第106页 |
| ·脂肪酶对各种底物的特异性 | 第106-107页 |
| ·讨论 | 第107-109页 |
| ·南极深海沉积物宏基因组低温脂肪酶基因的PCR克隆与表达及纯化性质 | 第109-117页 |
| ·DNA提取结果 | 第109页 |
| ·脂肪酶基因(lip3)的克隆和测序 | 第109-110页 |
| ·序列分析 | 第110-111页 |
| ·脂肪酶基因在大肠杆菌中的表达及产物纯化 | 第111-112页 |
| ·纯酶性质 | 第112-114页 |
| ·温度对酶活力及稳定性的影响 | 第112-113页 |
| ·pH值对酶活力及稳定性的影响 | 第113-114页 |
| ·温度对酶促反应的影响 | 第114页 |
| ·讨论 | 第114-117页 |
| 4 总结与展望 | 第117-119页 |
| 5 参考文献 | 第119-133页 |
| 附录一.EMBL数据库收录号 | 第133-148页 |
| 附录二.攻读硕士期间发表论文 | 第148-151页 |
| 发表和接受发表的文章 | 第148-149页 |
| 学术研讨会文章 | 第149-150页 |
| 获得学术奖励情况 | 第150-151页 |
| 致谢 | 第151页 |
