蜡样芽孢杆菌754-1株磷脂酶C基因的克隆、测序及表达
| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 缩略语表 | 第8-10页 |
| 1 文献综述 | 第10-18页 |
| ·磷脂酶与磷脂酶C | 第10-13页 |
| ·磷脂酶 | 第10页 |
| ·野生型磷脂酶C | 第10-12页 |
| ·磷脂酶C同功酶 | 第12-13页 |
| ·磷脂酶C作用机理 | 第13-16页 |
| ·PLC作用机理 | 第13-15页 |
| ·本实验室已有基础研究 | 第15-16页 |
| ·目前市场上的抗血小板聚集类药物 | 第16-18页 |
| 2 研究的目的意义 | 第18-20页 |
| ·迫切要求 | 第18页 |
| ·纯化需要 | 第18-19页 |
| ·意义 | 第19-20页 |
| ·选用高产新菌种 | 第19页 |
| ·采用新思路涉足PLC研究 | 第19页 |
| ·采用已相对较成熟的基因工程技术 | 第19-20页 |
| 3 材料与方法 | 第20-35页 |
| ·材料 | 第20-22页 |
| ·菌种和质粒 | 第20页 |
| ·酶及主要试剂 | 第20页 |
| ·主要仪器 | 第20-22页 |
| ·PCR引物合成与测序 | 第22页 |
| ·引物Ⅰ | 第22页 |
| ·引物Ⅱ | 第22页 |
| ·引物Ⅲ | 第22页 |
| ·引物Ⅳ | 第22页 |
| ·主要试剂及溶液的配制 | 第22-26页 |
| ·培养基和培养条件 | 第22-23页 |
| ·LB液体培养基 | 第22页 |
| ·LB卵黄培养基 | 第22页 |
| ·硼砂卵黄培养基 | 第22-23页 |
| ·Amp／LB培养基 | 第23页 |
| ·Amp／X-Gal／IPTG／LB平板培养基 | 第23页 |
| ·常用的酶及引物分装 | 第23-24页 |
| ·溶菌酶的分装 | 第23页 |
| ·蛋白酶K的分装 | 第23页 |
| ·引物的配制 | 第23-24页 |
| ·dNTP的分装 | 第24页 |
| ·E.coli感受态制备用试剂 | 第24页 |
| ·CaCl_2溶液 | 第24页 |
| ·TE溶液 | 第24页 |
| ·质粒抽提相关溶液 | 第24-25页 |
| ·溶液Ⅰ | 第24页 |
| ·溶液Ⅱ | 第24页 |
| ·溶液Ⅲ | 第24-25页 |
| ·包涵体提取用相关溶液 | 第25页 |
| ·Buffer A | 第25页 |
| ·细菌裂解缓冲液 | 第25页 |
| ·包涵体变性溶液 | 第25页 |
| ·其他 | 第25-26页 |
| ·氨苄青霉素 | 第25页 |
| ·IPTG | 第25页 |
| ·酚／氯仿／异戊醇 | 第25页 |
| ·DTT | 第25-26页 |
| ·EB贮存液 | 第26页 |
| ·TES缓冲液 | 第26页 |
| ·相关质粒载体和宿主菌 | 第26页 |
| ·实验方法 | 第26-35页 |
| ·基因提取方法 | 第26-28页 |
| ·细菌基因组DNA的提取 | 第26-27页 |
| ·质粒DNA的提取 | 第27-28页 |
| ·PCR扩增与检测 | 第28-29页 |
| ·PCR产物回收与纯化 | 第29-30页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第30-31页 |
| ·传统的CaCl_2转化法 | 第30页 |
| ·TB法 | 第30-31页 |
| ·PCR产物连接与转化 | 第31-32页 |
| ·PCR产物的克隆连接 | 第31页 |
| ·连接产物的转化 | 第31-32页 |
| ·用IPTG诱导表达 | 第32-33页 |
| ·重组菌生长曲线的建立 | 第32页 |
| ·最佳诱导时间的确定 | 第32页 |
| ·最佳诱导温度的确定 | 第32页 |
| ·最佳IPTG诱导浓度的确定 | 第32-33页 |
| ·包涵体提取及变、复性 | 第33-34页 |
| ·包涵体的提取 | 第33页 |
| ·包涵体的变、复性 | 第33页 |
| ·实验所采用的包涵体变、复性方案 | 第33-34页 |
| ·卵黄琼脂杯碟法检测活性 | 第34-35页 |
| 4 实验结果 | 第35-44页 |
| ·菌种的筛选与纯化 | 第35-36页 |
| ·蜡样芽胞杆菌 | 第35页 |
| ·大肠杆菌 | 第35-36页 |
| ·蜡样芽胞杆菌和大肠杆菌菌落形态的比较 | 第36页 |
| ·引物设计和基因分离 | 第36-39页 |
| ·多种序列的比对、引物的设计和限制性内切酶的选择 | 第36-37页 |
| ·PCR的程序优化 | 第37-39页 |
| ·模板浓度的选择 | 第37页 |
| ·退火温度的选择 | 第37-39页 |
| ·构建T载克隆载体 | 第39-41页 |
| ·双酶切鉴定 | 第39-41页 |
| ·PCR鉴定 | 第41页 |
| ·plc基因的序列测定结果及分析 | 第41页 |
| ·构建PET28A表达载体 | 第41-42页 |
| ·大肠杆菌中的诱导表达 | 第42页 |
| ·卵黄琼脂杯碟法初步检测酶活 | 第42-44页 |
| 5 分析与讨论 | 第44-46页 |
| ·磷脂酶C基因克隆的引物、载体、宿主菌选择 | 第44页 |
| ·选择表达载体构建不同表达系统 | 第44-45页 |
| ·包涵体的提取及溶解复性 | 第45-46页 |
| 参考文献 | 第46-52页 |
| 致谢 | 第52-53页 |
| 附录 | 第53-65页 |
