| 内容提要 | 第1-16页 |
| 摘要 | 第16-19页 |
| Abstract | 第19-22页 |
| 前言 | 第22-24页 |
| 第一部分 文献综述 | 第24-58页 |
| 综述一 牛病毒性腹泻病的研究概况 | 第24-44页 |
| 1 牛病毒性腹泻病病原学 | 第24-28页 |
| ·牛病毒性腹泻病毒分类位置 | 第24页 |
| ·牛病毒性腹泻病毒的形态和理化特性 | 第24页 |
| ·牛病毒性腹泻病毒基因组结构及功能 | 第24-26页 |
| ·5′端非编码区 | 第25页 |
| ·开放阅读框架区 | 第25-26页 |
| ·3′端非翻译区 | 第26页 |
| ·牛病毒性腹泻病毒基因组编码蛋白的结构及功能 | 第26-28页 |
| ·N~(pro) | 第26页 |
| ·E_0 | 第26页 |
| ·E_0 | 第26-27页 |
| ·E_1 | 第27页 |
| ·E_2 | 第27页 |
| ·P_7 | 第27页 |
| ·NS_(2-3) | 第27-28页 |
| ·NS_(4A)(P_(10))、NS_(4B)(P_(32))、NS_(5A)(P_(58))、NS_(5B)(P_(75)) | 第28页 |
| 2 牛病毒性腹泻病流行病学 | 第28-32页 |
| ·牛病毒性腹泻病流行趋势和特点 | 第28-30页 |
| ·牛病毒性腹泻病传染源、易感动物和传播途径 | 第30页 |
| ·牛病毒性腹泻病传染源 | 第30页 |
| ·牛病毒性腹泻病易感动物 | 第30页 |
| ·牛病毒性腹泻病传播途径 | 第30页 |
| ·牛病毒性腹泻病毒流行株的基因型分析 | 第30-31页 |
| ·牛病毒性腹泻病毒国外流行株基因型 | 第30-31页 |
| ·牛病毒性腹泻病毒我国流行株基因型 | 第31页 |
| ·牛病毒性腹泻病流行原因 | 第31-32页 |
| ·牛病毒性腹泻病毒与猪瘟病毒交叉感染 | 第31-32页 |
| ·牛病毒性腹泻病毒基因型的多样性 | 第32页 |
| ·牛病毒性腹泻病毒持续性感染 | 第32页 |
| 3 牛病毒性腹泻病临床类型 | 第32-33页 |
| ·病毒性腹泻 | 第32-33页 |
| ·持续性感染与免疫耐受 | 第33页 |
| ·粘膜病 | 第33页 |
| ·繁殖力下降 | 第33页 |
| ·血小板减少和出血性综合症 | 第33页 |
| 4 牛病毒性腹泻病诊断技术 | 第33-36页 |
| ·血清学中和实验 | 第33-34页 |
| ·酶联免疫吸附实验(ELISA) | 第34页 |
| ·分子生物学诊断技术 | 第34-36页 |
| ·分子生物学诊断的基因区域 | 第34-35页 |
| ·核酸杂交(NAH)技术 | 第35页 |
| ·反转录—多聚酶链式反应(RT-PCR)技术 | 第35-36页 |
| ·复合PCR诊断BVDV和HCV技术 | 第36页 |
| 5 牛病毒性腹泻病毒NCP型向CP型转化机制 | 第36-38页 |
| ·外源序列的插入 | 第36-37页 |
| ·自身的基因发生了重排和拷贝 | 第37页 |
| ·外源细胞序列插入的同时伴有病毒基因的复制 | 第37页 |
| ·缺陷干扰粒子(defectiveinterference，DI) | 第37页 |
| ·点突变 | 第37-38页 |
| 6 牛病毒性腹泻病的综合防制 | 第38-44页 |
| ·疫苗防制 | 第38-41页 |
| ·灭活苗 | 第38页 |
| ·弱毒苗 | 第38-40页 |
| ·基因工程苗 | 第40-41页 |
| ·药物防制 | 第41-44页 |
| ·利巴韦林 | 第41-42页 |
| ·芳香族阳离子化合物 | 第42页 |
| ·复合物1453 | 第42页 |
| ·干扰素 | 第42-43页 |
| ·中药 | 第43-44页 |
| 综述二 基因免疫的研究概况 | 第44-58页 |
| 1 基因疫苗免疫机制 | 第44-46页 |
| 2 基因疫苗的组成 | 第46-47页 |
| 3 基因疫苗的特点 | 第47页 |
| 4 影响基因免疫效果的因素 | 第47-58页 |
| ·载体质粒的影响 | 第47页 |
| ·基因疫苗的免疫方法及途径影响 | 第47-49页 |
| ·接种剂量、次数、容积及质粒质量的影响 | 第49-50页 |
| ·保护性抗原基因及其所编码抗原结构的影响 | 第50-51页 |
| ·基因疫苗质粒的高效导入的影响 | 第51-52页 |
| ·基因疫苗免疫佐剂的影响 | 第52-58页 |
| ·核酸质粒的免疫佐剂影响 | 第53页 |
| ·细胞因子基因的影响 | 第53-54页 |
| ·趋化因子和共刺激分子基因的影响 | 第54-55页 |
| ·基因佐剂联合应用的影响 | 第55页 |
| ·抗原靶向作用的影响 | 第55-58页 |
| 第二部分 实验研究 | 第58-128页 |
| 实验一 梅花鹿源牛病毒性腹泻病毒分离与鉴定 | 第58-67页 |
| 1 材料与方法 | 第58-60页 |
| ·试验材料与仪器 | 第58页 |
| ·病毒的分离培养和浓缩 | 第58页 |
| ·病毒理化特性测定和病毒中和试验 | 第58-59页 |
| ·病毒的毒力测定 | 第58页 |
| ·病毒的理化学鉴定 | 第58-59页 |
| ·中和试验鉴定 | 第59页 |
| ·电镜负染观察 | 第59页 |
| ·特异性引物设计与合成 | 第59-60页 |
| ·病毒细胞培养物总RNA提取 | 第60页 |
| ·反转录 | 第60页 |
| ·PCR扩增 | 第60页 |
| 2 结果与分析 | 第60-65页 |
| ·病毒的分离培养法鉴定结果 | 第60-62页 |
| ·病毒理化特性测定结果 | 第62-63页 |
| ·病毒的毒力测定结果 | 第62页 |
| ·病毒的理化学鉴定结果 | 第62-63页 |
| ·病毒中和试验结果 | 第63-64页 |
| ·电镜负染观察鉴定结果 | 第64-65页 |
| ·RT-PCR扩增鉴定结果 | 第65页 |
| 3 讨论 | 第65-66页 |
| ·关于梅花鹿感染BVDV的来源 | 第65-66页 |
| 4 小结 | 第66-67页 |
| 实验二 梅花鹿源BVDV分离株NS_(2-3)基因重要区的克隆与分析 | 第67-77页 |
| 1 材料与方法 | 第67页 |
| ·材料 | 第67页 |
| ·病毒培养和浓缩 | 第67页 |
| ·RNA的提取及鉴定 | 第67页 |
| ·引物的设计 | 第67页 |
| ·反转录 | 第67页 |
| ·PCR扩增 | 第67页 |
| ·CDNA片段的克隆与鉴定 | 第67页 |
| ·序列分析 | 第67页 |
| 2 结果 | 第67-74页 |
| ·梅花鹿源BVDV分离株RT-PCR扩增鉴定结果 | 第67-68页 |
| ·梅花鹿源BVDV分离株NS_(2-3)基因重要区重组pMD18-T／NS_(2-3)克隆质粒PCR鉴定结果 | 第68-69页 |
| ·梅花鹿源BVDV分离株NS_(2-3)基因重要区重组pMD18-T／NS_(2-3)克隆质粒酶切鉴定结果 | 第69页 |
| ·梅花鹿源BVDV分离株NS_(2-3)基因重要区测序结果 | 第69-71页 |
| ·梅花鹿源BVDV分离株NS_(2-3)基因重要区核苷酸序列分析结果 | 第71-72页 |
| ·梅花鹿源BVDV分离株NS_(2-3)基因重要区氨基酸序列分析结果 | 第72-74页 |
| 3 讨论 | 第74-75页 |
| ·关于梅花鹿源BVDV分离株致细胞病变机制 | 第74页 |
| ·关于梅花鹿感染BVDV原因 | 第74-75页 |
| ·关于梅花鹿BVDV分离株基因型 | 第75页 |
| 4 小结 | 第75-77页 |
| 实验三 梅花鹿源BVDV分离株E_0基因的克隆与序列分析 | 第77-90页 |
| 1 材料与方法 | 第77页 |
| ·材料 | 第77页 |
| ·方法 | 第77页 |
| ·病毒培养和浓缩 | 第77页 |
| ·RNA的提取 | 第77页 |
| ·引物的设计 | 第77页 |
| ·反转录 | 第77页 |
| ·PCR扩增 | 第77页 |
| ·cDNA片段的克隆与鉴定 | 第77页 |
| ·序列分析 | 第77页 |
| 2 结果 | 第77-87页 |
| ·梅花鹿源BVDV分离株RT-PCR扩增结果 | 第77-78页 |
| ·梅花鹿源BVDV分离株E_0基因重组pMD18-T／E_0克隆质粒PCR鉴定结果 | 第78-79页 |
| ·梅花鹿源BVDV分离株E_0基因重组pMD18-T／E_0克隆质粒酶切鉴定结果 | 第79页 |
| ·梅花鹿源BVDV分离株E_0基因测序结果 | 第79-80页 |
| ·梅花鹿源BVDV分离株E_0基因序列同源性及系统进化树分析结果 | 第80-81页 |
| ·梅花鹿源BVDV分离株E_0基因推导的氨基酸序列及同源性分析结果 | 第81-83页 |
| ·梅花鹿源BVDV分离株E_0蛋白特性的预测及与其他瘟病毒毒株比较分析结果 | 第83-87页 |
| 3 讨论 | 第87-88页 |
| ·关于梅花鹿源BVDV分离株基因型 | 第87页 |
| ·关于梅花鹿和牛之问BVDV传播 | 第87页 |
| ·关于用E_0基因核苷酸序列做BVDV基因分型依据 | 第87页 |
| ·关于BVDV和猪瘟疫苗 | 第87页 |
| ·关于E_0蛋白 | 第87-88页 |
| 4 小结 | 第88-90页 |
| 实验四 梅花鹿源BVDV分离株E_0基因原核表达 | 第90-100页 |
| 1 材料与方法 | 第90-93页 |
| ·材料 | 第90页 |
| ·酶、抗体及Marker | 第90页 |
| ·质粒和表达菌种 | 第90页 |
| ·质粒的小量提取试剂 | 第90页 |
| ·诱导表达试剂 | 第90页 |
| ·SDS-PAGE试剂 | 第90页 |
| ·Western-blotting试剂 | 第90页 |
| ·方法 | 第90-93页 |
| ·重组质粒pET-28a／E_0的构建 | 第90-91页 |
| ·重组质粒pET-28a／E_0鉴定 | 第91页 |
| ·诱导表达 | 第91页 |
| ·蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第91-92页 |
| ·westernb1otting分析 | 第92-93页 |
| 2 结果 | 第93-98页 |
| ·回收E_0基因片段结果 | 第93页 |
| ·原核表达pET28a空载体电泳结果 | 第93-94页 |
| ·原核表达载体与外源片段的定量比较结果 | 第94-95页 |
| ·梅花鹿分离株E_0基因重组pET28a／E_0质粒的初选结 | 第95页 |
| ·重组原核表达质粒PCR鉴定结果 | 第95-96页 |
| ·重组原核表达质粒酶切鉴定结果 | 第96-97页 |
| ·E_0基因表达产物SDS-PAGE的检测结果 | 第97页 |
| ·E_0基因表达产物Western-blotting的检测结果 | 第97-98页 |
| 3 讨论 | 第98页 |
| ·关于基因在大肠杆菌中的高效表达 | 第98页 |
| 4 小结 | 第98-100页 |
| 实验五 梅花鹿源BVDV分离株E_0基因的真核表达 | 第100-109页 |
| 1 材料与方法 | 第100-102页 |
| ·材料 | 第100页 |
| ·DNA酶切、连接、反转录、PCR及回收试剂 | 第100页 |
| ·质粒大量提取的试剂 | 第100页 |
| ·真核表达质粒pVAX1／E_0转染BHK-21细胞材料及病毒株 | 第100页 |
| ·ELISA法检测试剂 | 第100页 |
| ·方法 | 第100-102页 |
| ·重组真核表达质粒pVAX1／E_0的构建 | 第100-101页 |
| ·真核表达工程菌pVAX1／E_0重组质粒的鉴定 | 第101页 |
| ·真核表达质粒pVAX1／E_0转染BHK-21细胞 | 第101-102页 |
| ·真核表达质粒pVAX1／E_0在真核细胞中表达的检测 | 第102页 |
| 2 结果 | 第102-106页 |
| ·真核表达质粒pVAX1转化工程菌的结果 | 第102-103页 |
| ·pVAX1／E_0真核表达重组质粒PCR鉴定结果 | 第103-104页 |
| ·pVAX1／E_0真核表达载体酶切鉴定结果 | 第104页 |
| ·pVAX1／E_0大提质粒结果 | 第104-105页 |
| ·RT-PCR法检测pVAX1／E_0在真核细胞中转录结果 | 第105-106页 |
| ·间接ELISA法检测pVAX1／E_0在真核细胞中表达的结果 | 第106页 |
| 3 讨论 | 第106-108页 |
| ·关于真核表达载体 | 第106页 |
| ·关于基因疫苗质粒的高效导入 | 第106-108页 |
| 4 小结 | 第108-109页 |
| 实验六 梅花鹿源BVDV分离株基因苗的动物免疫试验 | 第109-118页 |
| 1 材料与方法 | 第109-112页 |
| ·材料 | 第109页 |
| ·载体质粒 | 第109页 |
| ·免疫学试剂 | 第109页 |
| ·实验动物 | 第109页 |
| ·质粒的大量提取试剂 | 第109页 |
| ·ELISA法检测试剂 | 第109页 |
| ·兔的淋巴细胞转化实验试剂与材料 | 第109页 |
| ·方法 | 第109-112页 |
| ·基因苗、灭活苗的制备 | 第110页 |
| ·兔的分组及各种疫苗的免疫剂量和次数 | 第110页 |
| ·各种疫苗免疫家兔的抗体检测 | 第110-111页 |
| ·T淋巴细胞转化实验 | 第111-112页 |
| ·B淋巴细胞转化实验 | 第112页 |
| ·统计分析 | 第112页 |
| 2 结果 | 第112-116页 |
| ·梅花鹿源BVDV基因苗与灭活苗免疫家兔的抗体检测比较结果 | 第112-116页 |
| ·梅花鹿源BVDV基因苗与灭活苗对家兔淋巴细胞增殖(A_(570))影响的结果 | 第116页 |
| 3 讨论 | 第116-117页 |
| ·关于基因苗的优点 | 第116-117页 |
| 4 小结 | 第117-118页 |
| 实验七 梅花鹿源BVDV分离株敏感药物筛选的研究 | 第118-128页 |
| 1 材料与方法 | 第118-120页 |
| ·材料 | 第118-119页 |
| ·试验药物 | 第118页 |
| ·MDBK细胞和BVDV病毒 | 第118页 |
| ·主要化学试剂 | 第118页 |
| ·试剂 | 第118页 |
| ·主要仪器 | 第118-119页 |
| ·方法 | 第119-120页 |
| ·药物安全浓度测试试验 | 第119页 |
| ·敏感药物筛选试验和MDBK单层细胞制备 | 第119-120页 |
| 2 结果 | 第120-125页 |
| ·试验药物对MDBK细胞贴壁影响的结果 | 第120-121页 |
| ·试验药物对MDBK细胞单层影响的结果 | 第121页 |
| ·试验药物在MDBK细胞上最大安全浓度确定结果 | 第121页 |
| ·先加药后加病毒方式药物抗BVDV效果比较结果 | 第121-122页 |
| ·先加病毒后加药方式药物抗BVDV效果比较结果 | 第122-124页 |
| ·药和病毒同时加方式药物抗BVDV效果比较结果 | 第124-125页 |
| ·药物抗BVDV抑制率比较结果 | 第125页 |
| 3 讨论 | 第125-126页 |
| ·关于中性红染料吸收法 | 第125页 |
| ·关于药物对组织细胞的毒性 | 第125页 |
| ·关于药物抗病毒作用量效关系 | 第125-126页 |
| ·关于抗病毒的药物 | 第126页 |
| 4 小结 | 第126-128页 |
| 结论 | 第128-129页 |
| 参考文献 | 第129-151页 |
| 致谢 | 第151-152页 |
| 导师简介 | 第152-153页 |
| 作者简介 | 第153-155页 |
