| 符号说明 | 第1-11页 |
| 摘要 | 第11-14页 |
| ABSTRACT | 第14-17页 |
| 一、重要的细胞因子对肝前体细胞诱导分化实验 | 第17-42页 |
| 前言 | 第17-18页 |
| 1 材料与方法 | 第18-22页 |
| ·材料 | 第18-19页 |
| ·实验动物及细胞来源 | 第18页 |
| ·主要试剂 | 第18页 |
| ·主要设备 | 第18-19页 |
| ·方法 | 第19-22页 |
| ·细胞培养 | 第19页 |
| ·提取细胞总RNA | 第19页 |
| ·逆转录PCR | 第19-20页 |
| ·各基因PCR 检测 | 第20页 |
| ·病毒感染滴度的确定 | 第20-21页 |
| ·荧光素酶活性检测 | 第21页 |
| ·PAS 染色观察细胞功能的改变 | 第21页 |
| ·ICG 摄取 | 第21-22页 |
| 2 实验结果 | 第22-28页 |
| ·永生化肝前体细胞的形态 | 第22页 |
| ·Real-time PCR 检测肝脏发育不同阶段标志物 | 第22-24页 |
| ·永生化肝前体细胞单克隆细胞株形态 | 第24-25页 |
| ·病毒感染滴度的确定 | 第25页 |
| ·荧光素酶活性检测 | 第25-26页 |
| ·PAS 染色 | 第26-27页 |
| ·ICG 摄取 | 第27-28页 |
| 3 讨论 | 第28-32页 |
| ·永生化肝前体细胞株的建立 | 第28页 |
| ·肝细胞发育不同阶段标志物的表达及意义 | 第28-29页 |
| ·永生化肝前体细胞克隆的筛选 | 第29-30页 |
| ·特定细胞因子诱导肝前体细胞分化的作用 | 第30-32页 |
| 4 结论 | 第32-33页 |
| 全文总结 | 第33-34页 |
| 参考文献 | 第34-42页 |
| 二、丙型肝炎病毒F 蛋白的原核表达与腺病毒构建 | 第42-89页 |
| 摘要 | 第42-44页 |
| ABSTRACT | 第44-47页 |
| 正文 | 第47-80页 |
| 前言 | 第47-49页 |
| 第一部分 丙型肝炎病毒F 蛋白原核表达载体的构建表达和纯化 | 第49-66页 |
| 1 材料 | 第49-51页 |
| ·质粒与菌株 | 第49页 |
| ·主要试剂 | 第49-50页 |
| ·其它试剂 | 第50-51页 |
| ·主要仪器 | 第51页 |
| 2 方法 | 第51-61页 |
| ·F 基因引物设计 | 第51-52页 |
| ·F 基因扩增 | 第52页 |
| ·PCR 产物纯化 | 第52-53页 |
| ·PCR 产物回收 | 第53页 |
| ·pET-32a(+)载体的制备 | 第53-54页 |
| ·碱裂解法提取pET-32a(+) | 第53-54页 |
| ·载体酶切 | 第54页 |
| ·目的基因与载体连接 | 第54-55页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌JM109 | 第55页 |
| ·化学感受态大肠杆菌JM109 的制备 | 第55页 |
| ·转化 | 第55页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第55-57页 |
| ·菌落PCR | 第55-56页 |
| ·重组质粒酶切鉴定 | 第56-57页 |
| ·测序鉴定 | 第57页 |
| ·F 基因的高效表达 | 第57-59页 |
| ·F 蛋白的诱导表达 | 第57-58页 |
| ·纯化重组蛋白的免疫印迹鉴定（Western blot） | 第58-59页 |
| ·重组质粒的大量诱导表达 | 第59页 |
| ·判断重组蛋白在大肠杆菌的表达 | 第59页 |
| ·包涵体的纯化 | 第59-61页 |
| ·破碎细菌 | 第59-60页 |
| ·洗涤溶解包涵体 | 第60页 |
| ·亲合层析纯化 | 第60-61页 |
| 3 结果 | 第61-64页 |
| ·PCR 扩增产物鉴定 | 第61页 |
| ·重组质粒酶切与PCR 鉴定 | 第61-62页 |
| ·F 蛋白的诱导表达及SDS-PAGE 分析 | 第62-63页 |
| ·融合蛋白的Western blot 鉴定 | 第63-64页 |
| ·表达蛋白的复性与亲和层析纯化 | 第64页 |
| 4 讨论 | 第64-65页 |
| 5 结论 | 第65-66页 |
| 第二部分丙型肝炎病毒F 蛋白腺病毒的构建 | 第66-80页 |
| 1 材料 | 第66-67页 |
| ·质粒、菌株、细胞株 | 第66页 |
| ·主要试剂 | 第66页 |
| ·主要仪器 | 第66-67页 |
| 2 方法 | 第67-74页 |
| ·目的基因的获取 | 第67-68页 |
| ·引物设计 | 第67页 |
| ·PCR 扩增F 基因 | 第67-68页 |
| ·乙醇沉淀法纯化DNA | 第68页 |
| ·目的基因与穿梭质粒连接 | 第68-70页 |
| ·BamHⅠ和 HindIII 酶切穿梭质粒 pAdTrack-TO4 | 第68-69页 |
| ·连接 | 第69页 |
| ·电转感受态细菌JM109 的制备 | 第69-70页 |
| ·转化 | 第70页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第70-71页 |
| ·菌落PCR（方法同前） | 第70页 |
| ·酶切鉴定 | 第70页 |
| ·测序鉴定 | 第70-71页 |
| ·穿梭质粒与骨架质粒于BJ5183 内同源重组 | 第71页 |
| ·碱裂解法提取骨架质粒AdEasy-1 | 第71页 |
| ·电转AdEasy-1 入BJ5183 菌（方法同前） | 第71页 |
| ·电转感受态BJ5183 的制备（方法同前） | 第71页 |
| ·重组质粒pAdTrack-T04-F 线性化 | 第71页 |
| ·电转pAdTrack-T04-F 入含有骨架质粒的BJ5183 菌（方法同前） | 第71页 |
| ·重组腺病毒质粒鉴定 | 第71-72页 |
| ·菌落PCR（方法同前） | 第71页 |
| ·酶切鉴定 | 第71-72页 |
| ·Mini 方法提取阳性质粒，转化DH5α（过程同前） | 第72页 |
| ·质粒快速抽提纯化试剂盒（promega）提取质粒 | 第72页 |
| ·腺病毒质粒准备 | 第72-73页 |
| ·HEK293 细胞转染 | 第73页 |
| ·荧光检测 | 第73页 |
| ·腺病毒包装 | 第73-74页 |
| 3 结果 | 第74-77页 |
| ·PCR 扩增目的基因 | 第74页 |
| ·酶切鉴定 | 第74-75页 |
| ·重组质粒 PCR 鉴定 | 第75页 |
| ·骨架质粒转化 | 第75-76页 |
| ·酶切鉴定 | 第76-77页 |
| ·转染 | 第77页 |
| 4 讨论 | 第77-79页 |
| 5 结论 | 第79-80页 |
| 全文总结 | 第80-81页 |
| 参考文献 | 第81-89页 |
| 致谢 | 第89-90页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第90页 |
