| 致谢 | 第5-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-34页 |
| 1.1 引言 | 第14-15页 |
| 1.2 5-氨基乙酰丙酸的应用与市场前景 | 第15-19页 |
| 1.2.1 5-氨基乙酰丙酸在农业上的应用 | 第15-17页 |
| 1.2.2 5-氨基乙酰丙酸在医学上的运用 | 第17-19页 |
| 1.3 ALA的生产方法 | 第19-28页 |
| 1.3.1 5-氨基乙酰丙酸的生产 | 第19-20页 |
| 1.3.2 化学法合成ALA | 第20页 |
| 1.3.3 生物法途径合成5-氨基乙酰丙酸 | 第20页 |
| 1.3.4 诱变育种法生产5-氨基乙酰丙酸 | 第20-21页 |
| 1.3.5 代谢改造构建5-氨基乙酰丙酸高产菌株 | 第21-23页 |
| 1.3.6 与5-氨基乙酰丙酸合成相关基因的修饰与改造 | 第23-24页 |
| 1.3.7 5-氨基乙酰丙酸下游代谢途径的改造与调控 | 第24-25页 |
| 1.3.8 对整体代谢流调控优化促进ALA合成 | 第25-26页 |
| 1.3.9 降低胞内ALA浓度 | 第26-27页 |
| 1.3.10 其他策略提高ALA产量 | 第27-28页 |
| 1.3.11 未来ALA高产菌株的研究方向 | 第28页 |
| 1.4 膜转运蛋白 | 第28-33页 |
| 1.4.1 小分子化合物外向转运蛋白 | 第29-30页 |
| 1.4.2 细菌中的氨基酸外向转运蛋白 | 第30-31页 |
| 1.4.3 ALA外向转运蛋白研究现状 | 第31-32页 |
| 1.4.4 ALA底物类似物的外向转运蛋白及其应用 | 第32-33页 |
| 1.5 本研究工作思路 | 第33-34页 |
| 第二章 重组菌株的构建及合成酶表达优化 | 第34-48页 |
| 2.1 引言 | 第34-35页 |
| 2.2 材料和方法 | 第35-42页 |
| 2.2.1 质粒与菌株 | 第35-36页 |
| 2.2.2 培养基配制及使用 | 第36-37页 |
| 2.2.3 菌种培养方法 | 第37页 |
| 2.2.4 酶与试剂盒 | 第37-38页 |
| 2.2.5 大肠杆菌细胞超声破碎及胞内蛋白的提取 | 第38页 |
| 2.2.6 ALA化学显色法检测浓度 | 第38页 |
| 2.2.7 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第38-39页 |
| 2.2.8 重组质粒及菌株的构建 | 第39-40页 |
| 2.2.9 重组连接构建重组质粒 | 第40-41页 |
| 2.2.10 hemA基因表达 | 第41-42页 |
| 2.2.11 培养条件优化 | 第42页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第42-47页 |
| 2.3.1 pACYCDuet-hemA质粒的构建 | 第42-43页 |
| 2.3.2 质粒上的His标签对hemA基因表达的影响 | 第43页 |
| 2.3.3 重组质粒的构建 | 第43-44页 |
| 2.3.4 LB培养基与摇瓶培养基对ALA积累的影响 | 第44-45页 |
| 2.3.5 诱导剂IPTG添加量对ALA积累的影响 | 第45-46页 |
| 2.3.6 诱导温度对对ALA积累的影响 | 第46-47页 |
| 2.4 小结 | 第47-48页 |
| 第三章 基因的初步筛选及ALA的胞内检测 | 第48-60页 |
| 3.1 引言 | 第48页 |
| 3.2 材料与方法 | 第48-52页 |
| 3.2.1 质粒与菌株 | 第48-49页 |
| 3.2.2 菌株培养条件 | 第49页 |
| 3.2.3 CRISPR/Cas9基因敲除技术 | 第49-50页 |
| 3.2.4 电击转化感受态 | 第50-51页 |
| 3.2.5 菌体收集与预处理 | 第51页 |
| 3.2.6 超声破碎破胞法 | 第51-52页 |
| 3.2.7 煮沸破胞法 | 第52页 |
| 3.2.8 液氮冻融破胞法 | 第52页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第52-58页 |
| 3.3.1 各基因过表达对细胞生长和细胞外ALA积累量的影响 | 第52-53页 |
| 3.3.2 rhtA基因敲除菌株的构建 | 第53-54页 |
| 3.3.3 过表达各基因对rhtA敲除菌株ALA产量的影响 | 第54-55页 |
| 3.3.4 胞内ALA测定方法的确定 | 第55-56页 |
| 3.3.5 盐酸浓度对破胞效率的影响 | 第56页 |
| 3.3.6 盐酸浸泡时间对破胞效率的影响 | 第56-57页 |
| 3.3.7 盐酸浸泡温度对破胞效率的影响 | 第57-58页 |
| 3.4 小结 | 第58-60页 |
| 第四章 外向转运蛋白在基因敲除菌株中对ALA分泌的影响 | 第60-73页 |
| 4.1 引言 | 第60页 |
| 4.2 材料与方法 | 第60-65页 |
| 4.2.1 rhtCB与yeeO基因敲除 | 第60页 |
| 4.2.2 基因敲除重组菌株摇瓶实验 | 第60-62页 |
| 4.2.3 rhtA基因敲除的重组菌株之间细胞内外ALA浓度变化曲线 | 第62页 |
| 4.2.4 rhtCB基因敲除的重组菌株之间细胞内外ALA浓度变化曲线 | 第62页 |
| 4.2.5 yeeO基因敲除的重组菌株之间细胞内外ALA浓度变化曲线 | 第62页 |
| 4.2.6 ALA高效液相色谱法检测浓度 | 第62-63页 |
| 4.2.7 补料发酵培养验证过表达RhtA对重组菌株产量的影响 | 第63-65页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第65-72页 |
| 4.3.1 rhtCB基因与yeeO基因敲除菌株的构建 | 第65-66页 |
| 4.3.2 rhtA基因对重组菌株分泌ALA的影响 | 第66-67页 |
| 4.3.3 rhtCB基因对重组菌株分泌ALA的影响 | 第67-69页 |
| 4.3.4 yeeO基因对重组菌株分泌ALA的影响 | 第69-70页 |
| 4.3.5 rhtA基因在重组菌株发酵培养中对ALA产量的影响 | 第70-72页 |
| 4.4 小结 | 第72-73页 |
| 第五章 结论与展望 | 第73-75页 |
| 5.1 结论 | 第73-74页 |
| 5.2 展望 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-83页 |
| 附录 | 第83-84页 |
| 作者简介 | 第84页 |
