| 摘要 | 第5-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 目录 | 第10-12页 |
| 1 前言 | 第12-24页 |
| 1.1 CRISPR/Cas 系统 | 第12-17页 |
| 1.1.1 基因编辑 | 第12-13页 |
| 1.1.2 CRISPR/Cas 系统研究历史 | 第13页 |
| 1.1.3 CRISPR/Cas 系统的基本结构和分类 | 第13-15页 |
| 1.1.4 CRISPR/Cas 系统：一种新的基因组编辑工具 | 第15-16页 |
| 1.1.5 CRISPR/Cas 系统存在的问题 | 第16-17页 |
| 1.2 microRNA | 第17-21页 |
| 1.2.1 microRNA 的研究现状 | 第17页 |
| 1.2.2 microRNA 的概念及特征 | 第17-18页 |
| 1.2.3 microRNA 的加工过程 | 第18-19页 |
| 1.2.4 microRNA 的作用机制 | 第19-20页 |
| 1.2.5 microRNA 的表达 | 第20-21页 |
| 1.2.6 microRNA 的功能 | 第21页 |
| 1.3 立题背景 | 第21-22页 |
| 1.3.1 mir-505 | 第21-22页 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas 系统介导 mir-505 敲除细胞 | 第22页 |
| 1.4 研究内容 | 第22-23页 |
| 1.5 研究意义 | 第23-24页 |
| 2 材料与方法 | 第24-48页 |
| 2.1 材料 | 第24-27页 |
| 2.1.1 生物材料 | 第24页 |
| 2.1.2 实验试剂与仪器 | 第24-27页 |
| 2.2 方法 | 第27-46页 |
| 2.2.1 sgRNA 表达载体的构建流程 | 第27-33页 |
| 2.2.2 打靶载体的构建流程 | 第33-40页 |
| 2.2.3 细胞培养 | 第40-42页 |
| 2.2.4 细胞基因组 DNA 的抽提及定量 | 第42页 |
| 2.2.5 细胞总 RNA 的抽提及定量 | 第42-43页 |
| 2.2.6 T7E1 assay | 第43-44页 |
| 2.2.7 实时荧光定量 PCR | 第44-46页 |
| 2.3 数据分析 | 第46-48页 |
| 3 结果与分析 | 第48-69页 |
| 3.1 mir-505 基因 sgRNA 的设计 | 第48页 |
| 3.2 sgRNA 表达载体的构建 | 第48-51页 |
| 3.2.1 41824-sgRNA(1)载体构建 | 第48-50页 |
| 3.2.2 42230-sgRNA 载体构建 | 第50-51页 |
| 3.3 打靶载体的构建 | 第51-57页 |
| 3.3.1 EGFP 打靶载体的构建 | 第51-55页 |
| 3.3.2 无 EGFP 打靶载体的构建 | 第55-57页 |
| 3.4 T7E1 assay 检测 CRISPR/Cas 系统对 mir-505 靶点的剪切效率 | 第57-62页 |
| 3.4.1 剪切效率与 sgRNA 和 Cas9 蛋白的剂量相关 | 第58页 |
| 3.4.2 剪切效率与 sgRNA 和 Cas9 蛋白的共传递相关 | 第58-59页 |
| 3.4.3 剪切效率与 sgRNA 的 GC%相关 | 第59-60页 |
| 3.4.4 剪切效率存在细胞系间差异 | 第60-61页 |
| 3.4.5 CRISPR/Cas 系统介导 mir-505 基因位点测序结果 | 第61-62页 |
| 3.5 G418 筛选 mir-505 knockout 细胞 | 第62-64页 |
| 3.5.1 G418 筛选 mir-505 knockout 细胞原理 | 第62页 |
| 3.5.2 G418 最低致死浓度的确定 | 第62-63页 |
| 3.5.3 无 EGFP 的 mir-505 knockout 细胞筛选 | 第63-64页 |
| 3.5.4 携带 EGFP 的 mir-505 knockout 细胞筛选 | 第64页 |
| 3.6 mir-505 knockout 细胞的检测 | 第64-67页 |
| 3.6.1 mir-505 knockout 细胞 PCR 分型结果 | 第64-65页 |
| 3.6.2 mir-505 knockout 细胞 mir-505 拷贝数检测 | 第65-66页 |
| 3.6.3 mir-505 knockout 细胞生长曲线的测定 | 第66-67页 |
| 3.7 mir-505 双等位基因 knockout 细胞的获得 | 第67页 |
| 3.8 CRISPR/Cas 系统特异性 | 第67-69页 |
| 4 讨论 | 第69-71页 |
| 4.1 一步克隆法载体构建 | 第69页 |
| 4.2 CRISPR/Cas 系统的 off-target | 第69-70页 |
| 4.3 打靶载体同源臂长度的设计 | 第70页 |
| 4.4 G418 筛选稳转株 | 第70-71页 |
| 5 结论及展望 | 第71-73页 |
| 5.1 结论 | 第71-72页 |
| 5.2 展望 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-80页 |
| 课题来源 | 第80-81页 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文目录 | 第81-82页 |
| 致谢 | 第82页 |
