| 摘要 | 第3-4页 |
| abstract | 第4页 |
| 缩略语表 | 第9-10页 |
| 1 引言 | 第10-15页 |
| 1.1 鸭瘟概述 | 第10-13页 |
| 1.1.1 传播途径及流行病学 | 第11页 |
| 1.1.2 临诊症状及病理变化 | 第11页 |
| 1.1.3 基因组特征 | 第11-12页 |
| 1.1.4 主要蛋白结构特性 | 第12-13页 |
| 1.2 α疱疹病毒载体的研究 | 第13页 |
| 1.3 重组α疱疹病毒的构建与应用 | 第13页 |
| 1.4 鸭瘟重组病毒载体的研究 | 第13-14页 |
| 1.5 CRISPR-Cas9技术 | 第14-15页 |
| 1.5.1 CRISPR-Cas9的作用机理 | 第14-15页 |
| 1.5.2 CRISPR-Cas9靶位点的选择及相关工具 | 第15页 |
| 1.6 研究目的和意义 | 第15页 |
| 2 材料与方法 | 第15-26页 |
| 2.1 材料 | 第15-17页 |
| 2.1.1 质粒、感受态、病毒、鸡胚 | 第15-16页 |
| 2.1.2 试剂 | 第16页 |
| 2.1.3 配置试剂 | 第16页 |
| 2.1.4 主要仪器与设备 | 第16-17页 |
| 2.2 方法 | 第17-18页 |
| 2.2.1 DPV的增殖与毒力测定 | 第17-18页 |
| 2.2.1.1 CEF的制备 | 第17页 |
| 2.2.1.2 DPV的增殖 | 第17-18页 |
| 2.2.2 病毒滴度的测定(TCID50) | 第18页 |
| 2.3 病毒重组目的基因片段的构建 | 第18-21页 |
| 2.3.1 同源臂的构建 | 第18-19页 |
| 2.3.1.1 引物的设计与合成 | 第18-19页 |
| 2.3.1.2 病毒DNA的提取 | 第19页 |
| 2.3.1.3 同源臂的扩增 | 第19页 |
| 2.3.1.4 PCR产物的纯化 | 第19页 |
| 2.3.2 同源重组质粒的构建 | 第19-20页 |
| 2.3.2.1 PUC19-EGFP质粒的前处理 | 第19-20页 |
| 2.3.2.2 连接 | 第20页 |
| 2.3.3 阳性重组质粒的筛选 | 第20页 |
| 2.3.3.1 转化 | 第20页 |
| 2.3.3.2 筛选阳性质粒及扩大培养 | 第20页 |
| 2.3.4 阳性重组质粒的鉴定 | 第20-21页 |
| 2.3.4.1 质粒的提取 | 第20-21页 |
| 2.3.4.2 同源重组质粒的测序 | 第21页 |
| 2.3.5 同源重组质粒的线性化与纯化 | 第21页 |
| 2.4 PX-330Cas9/gRNA质粒的构建 | 第21-22页 |
| 2.4.1 gRNA的设计与合成 | 第21-22页 |
| 2.4.2 双链退火 | 第22页 |
| 2.4.3 PX-330质粒的酶切 | 第22页 |
| 2.4.4 酶切产物的纯化与回收 | 第22页 |
| 2.4.5 连接反应 | 第22页 |
| 2.5 阳性质粒的筛选 | 第22-23页 |
| 2.5.1 转化 | 第22-23页 |
| 2.5.2 筛选阳性质粒 | 第23页 |
| 2.5.3 质粒的提取 | 第23页 |
| 2.5.4 PX-330Cas9/gRNA的鉴定 | 第23页 |
| 2.5.5 PX-330Cas9/gRNA的测序 | 第23页 |
| 2.6 重组病毒的拯救 | 第23-24页 |
| 2.6.1 电转染条件的优化 | 第23-24页 |
| 2.6.2 共转染 | 第24页 |
| 2.6.3 感作病毒 | 第24页 |
| 2.7 重组病毒的的筛选 | 第24-25页 |
| 2.8 重组病毒的鉴定 | 第25-26页 |
| 2.8.1 增殖重组病毒 | 第25页 |
| 2.8.2 重组病毒DNA的提取 | 第25页 |
| 2.8.3 鉴定引物的设计与合成 | 第25页 |
| 2.8.4 PCR鉴定 | 第25-26页 |
| 3 结果 | 第26-34页 |
| 3.1 DPV的增殖与毒力测定 | 第26页 |
| 3.1.1 细胞病变结果 | 第26页 |
| 3.1.2 病毒滴度的测定结果(TCID50) | 第26页 |
| 3.2 病毒重组目的基因片段的构建 | 第26-29页 |
| 3.2.1 同源臂的扩增结果 | 第26-27页 |
| 3.2.2 PUC19-EGFP质粒双酶切结果 | 第27-28页 |
| 3.2.3 同源重组质粒线性化的结果 | 第28-29页 |
| 3.3 PX-330Cas9/gRNA质粒的构建 | 第29-30页 |
| 3.3.1 PX-330质粒的酶切结果 | 第29页 |
| 3.3.2 PX-330Cas9/gRNA的鉴定结果 | 第29-30页 |
| 3.4 重组病毒的拯救 | 第30-32页 |
| 3.4.1 电转染条件优化的结果 | 第30-31页 |
| 3.4.2 共转染的结果 | 第31-32页 |
| 3.5 重组病毒筛选的结果 | 第32-33页 |
| 3.6 重组病毒的鉴定 | 第33-34页 |
| 3.6.1 增殖重组病毒的结果 | 第33页 |
| 3.6.2 PCR鉴定结果 | 第33-34页 |
| 4 讨论 | 第34-35页 |
| 5 结论 | 第35-36页 |
| 致谢 | 第36-37页 |
| 参考文献 | 第37-40页 |
| 作者简介 | 第40页 |