| 摘要 | 第10-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 1 前言 | 第13-24页 |
| 1.1 奶牛乳腺发育的研究进展 | 第13-14页 |
| 1.1.1 奶牛乳房和乳腺的解剖结构 | 第13页 |
| 1.1.2 奶牛乳腺发育的形态学和功能学变化 | 第13-14页 |
| 1.2 奶牛乳腺泌乳机理及营养调节机制 | 第14-16页 |
| 1.2.1 乳汁的合成与分泌机制 | 第14-15页 |
| 1.2.2 催乳素对泌乳的调节作用 | 第15-16页 |
| 1.3 奶牛乳腺上皮细胞体外培养的研究进展 | 第16-18页 |
| 1.3.1 乳腺细胞的原代培养 | 第16-17页 |
| 1.3.2 奶牛乳腺上皮细胞系的建立 | 第17-18页 |
| 1.4 泌乳相关信号转导途径及泌乳功能基因的筛选 | 第18-21页 |
| 1.4.1 泌乳相关信号通路 | 第18-20页 |
| 1.4.2 乳腺泌乳功能基因组学的研究进展 | 第20-21页 |
| 1.5 Pten基因功能的研究进展 | 第21-23页 |
| 1.5.1 Pten基因的发现 | 第21页 |
| 1.5.2 Pten基因及其编码蛋白的结构 | 第21-22页 |
| 1.5.3 Pten基因的作用机制和功能 | 第22-23页 |
| 1.6 研究目的和意义 | 第23-24页 |
| 2 材料与方法 | 第24-49页 |
| 2.1 实验材料、试剂和仪器 | 第24-26页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第24页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第24-25页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第25-26页 |
| 2.2 实验方法 | 第26-49页 |
| 2.2.1 qRT-PCR检测奶牛乳腺组织Pten mRNA的表达 | 第26-29页 |
| 2.2.2 Western blotting检测奶牛乳腺组织PTEN蛋白的表达 | 第29-32页 |
| 2.2.3 PTEN蛋白在奶牛乳腺组织中的免疫荧光定位与半定量分析 | 第32-33页 |
| 2.2.4 奶牛乳腺上皮细胞的培养与鉴定 | 第33-35页 |
| 2.2.5 PTEN蛋白在奶牛乳腺上皮细胞中的定位分析 | 第35页 |
| 2.2.6 Pten基因过表达对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响 | 第35-44页 |
| 2.2.7 Pten基因抑制对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响 | 第44-47页 |
| 2.2.8 催乳素和葡萄糖对奶牛乳腺上皮细胞中Pten基因表达的影响 | 第47-48页 |
| 2.2.9 数据的处理和统计分析 | 第48-49页 |
| 3 结果 | 第49-81页 |
| 3.1 奶牛乳腺组织中Pten基因的mRNA表达水平 | 第49-51页 |
| 3.1.1 奶牛乳腺组织RNA提取的电泳结果 | 第49页 |
| 3.1.2 荧光定量qRT-PCR检测目的基因的mRNA表达 | 第49-51页 |
| 3.2 奶牛乳腺组织中PTEN蛋白的表达水平 | 第51-52页 |
| 3.3 PTEN蛋白的乳腺组织免疫荧光定位与半定量分析 | 第52-53页 |
| 3.4 泌乳期奶牛乳腺上皮细胞的体外培养及鉴定 | 第53-55页 |
| 3.4.1 奶牛乳腺上皮细胞的纯化和鉴定 | 第53-54页 |
| 3.4.2 奶牛乳腺上皮细胞的角蛋白18鉴定结果 | 第54-55页 |
| 3.5 目的蛋白PTEN激光共聚焦细胞内定位的观察 | 第55页 |
| 3.6 Pten基因过表达的实验结果 | 第55-67页 |
| 3.6.1 Pten基因PCR扩增产物 | 第55-56页 |
| 3.6.2 测序结果 | 第56页 |
| 3.6.3 pGCMV-Pten-IRES-EGFP真核表达载体的构建和重组质粒的酶切验证 | 第56-57页 |
| 3.6.4 去内毒素质粒的双酶切法验证 | 第57页 |
| 3.6.5 最佳转染时间的筛选 | 第57-58页 |
| 3.6.6 细胞转染试剂的最佳浓度和基因过表达效率检测 | 第58-59页 |
| 3.6.7 Pten基因过表达对奶牛乳腺上皮细胞功能的影响 | 第59-67页 |
| 3.7 Pten基因抑制的实验结果 | 第67-77页 |
| 3.7.1 Pten siRNA最佳干扰片段和最佳干扰时间 | 第67-68页 |
| 3.7.2 Pten siRNA的最佳转染浓度和干扰效率 | 第68-69页 |
| 3.7.3 Pten基因抑制对奶牛乳腺上皮细胞功能的影响 | 第69-77页 |
| 3.8 催乳素和葡萄糖处理对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能和Pten基因表达水平的影响 | 第77-79页 |
| 3.8.1 催乳素和葡萄糖处理对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响 | 第77-78页 |
| 3.8.2 催乳素和葡萄糖处理对奶牛乳腺上皮细胞Pten基因表达水平的影响 | 第78-79页 |
| 3.9 Pten基因调节奶牛乳腺上皮细胞泌乳图解 | 第79-81页 |
| 4 讨论 | 第81-86页 |
| 4.1 Pten基因在不同泌乳时期奶牛乳腺组织中的表达差异分析 | 第81页 |
| 4.2 Pten基因过表达和抑制对奶牛乳腺上皮细胞活力和细胞周期的影响 | 第81页 |
| 4.3 Pten基因过表达和抑制对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响 | 第81-82页 |
| 4.4 Pten基因过表达和抑制对泌乳相关通路基因表达的影响 | 第82-84页 |
| 4.4.1 细胞增殖与周期相关通路基因 | 第82页 |
| 4.4.2 乳蛋白合成相关通路基因 | 第82-83页 |
| 4.4.3 乳脂肪合成相关通路基因 | 第83-84页 |
| 4.4.4 乳糖合成相关通路基因 | 第84页 |
| 4.5 Pten基因参与催乳素诱导的葡萄糖转化为乳糖的调节作用 | 第84-86页 |
| 5 结论 | 第86-87页 |
| 致谢 | 第87-88页 |
| 参考文献 | 第88-95页 |
| 附录 | 第95-96页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第96页 |
