| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| Contents | 第7-9页 |
| Abbreviations | 第9-10页 |
| 1 Introduction | 第10-17页 |
| 1.1 Monoclonal antibodies for therapy | 第10页 |
| 1.2 The structure of the single-chain variable fragment | 第10-11页 |
| 1.3 scFv involved in tumor therapy research progress | 第11-12页 |
| 1.4 Intrabodies and intracellular delivery of antibodies | 第12页 |
| 1.5 Gene therapy and its applications | 第12-13页 |
| 1.6 The roles of human acidic fibroblast growth factor(aFGF) | 第13-14页 |
| 1.7 Pseudomonas exotoxin A domain Ⅱ(PEⅡ) | 第14页 |
| 1.8 Human epidermal growth factor receptor binding fragment(hEGFfr) | 第14-15页 |
| 1.9 Purpose and significance of this study | 第15-17页 |
| 2 Materials and Methods | 第17-30页 |
| 2.1 Cell lines,bacterial strains,yeast strain and vectors | 第17页 |
| 2.2 Reagents | 第17页 |
| 2.3 Flow cytometry | 第17-18页 |
| 2.4 Animal model | 第18-19页 |
| 2.4.1 Electroporation | 第18-19页 |
| 2.4.2 Histological analysis | 第19页 |
| 2.5 Expression of fusion protein into E.coli | 第19-24页 |
| 2.5.1 PCR amplification of hEGFfr-PEⅡ-scFv fusion gene | 第19-20页 |
| 2.5.2 Double enzyme digestion | 第20页 |
| 2.5.3 Ligation reaction | 第20页 |
| 2.5.4 Transformation | 第20-21页 |
| 2.5.5 Expression and analysis of recombinant hEGFfr-PEⅡ-scFv protein | 第21-22页 |
| 2.5.5.1 Small-scale expression screening | 第21页 |
| 2.5.5.2 Large-scale expression and protein solubility screening | 第21-22页 |
| 2.5.6 Purification of His-tagged fusion protein by Ni-NTA affinity chromatography | 第22页 |
| 2.5.7 Refolding and dialysis | 第22-23页 |
| 2.5.8 SDS-PAGE and Western blot analysis | 第23页 |
| 2.5.9 Antigen binding activity of the hEGFfr-PEⅡ-scFv protein detected by ELISA assay | 第23-24页 |
| 2.6 Expression of fusion protein into Pichia Pastoris | 第24-30页 |
| 2.6.1 PCR amplification of His*Tag-hEGFfr-PEⅡ-scFv fusion gene | 第24页 |
| 2.6.2 Double enzyme digestion | 第24-25页 |
| 2.6.3 Ligation reaction | 第25页 |
| 2.6.4 Transformation | 第25页 |
| 2.6.5 Preparation of transforming DNA | 第25-26页 |
| 2.6.6 Electroporation of P.pastoris | 第26页 |
| 2.6.7 In Vivo screening of multiple inserts | 第26-27页 |
| 2.6.8 PCR analysis of P.pastoris integrants | 第27-28页 |
| 2.6.8.1 Total DNA isolation from P.pastoris | 第27页 |
| 2.6.8.2 Identification of integrations into P.pastoris | 第27-28页 |
| 2.6.9 Expression of recombinant Pichia strains | 第28-29页 |
| 2.6.10 Analysis by SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Western Blot | 第29-30页 |
| 2.6.10.1 Preparation of supernatant | 第29页 |
| 2.6.10.2 Protein analysis | 第29-30页 |
| 3 Results and Analysis | 第30-38页 |
| 3.1 scFv expression led to cell cycle G1 phase arrest | 第30-31页 |
| 3.2 Electroporation of scFv into solid tumor | 第31页 |
| 3.3 Construction of hEGFfr-PEⅡ-scFv for E.coli expression | 第31-32页 |
| 3.4 Expression of hEGFfr-PEⅡ-scFv in E.coli BL21(DE3) | 第32-34页 |
| 3.5 Antigen binding activity of the hEGFfr-PEⅡ-scFv | 第34页 |
| 3.6 Construction of hEGFfr-PEAⅡ-scFv for yeast expression | 第34-35页 |
| 3.7 Screen for Geneticin~(?) resistant transformants | 第35-36页 |
| 3.8 Recombination and integration in P.pastoris | 第36-38页 |
| 4 Discussion | 第38-40页 |
| 5 Conclusions | 第40-41页 |
| References | 第41-46页 |
| Acknowledgments | 第46-47页 |
| Publieation | 第47-48页 |
| 附表 | 第48页 |
