| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 综述与导言 | 第10-20页 |
| 1.1 海藻酸生物合成的遗传学 | 第10页 |
| 1.2 海藻酸类酶系的探究性发展 | 第10-16页 |
| 1.2.1 可分解代谢海藻酸酶的微生物 | 第11页 |
| 1.2.2 海藻酸盐类裂解酶系的划分 | 第11-12页 |
| 1.2.3 海藻酸裂解酶系的底物专一偏爱性 | 第12-13页 |
| 1.2.4 海藻酸盐类裂解酶的催化机制及结构特征 | 第13-14页 |
| 1.2.5 海藻酸盐类裂解酶系的酶学特性 | 第14-16页 |
| 1.3 海藻酸生产生物燃料和可再生性日用化学品的微生物平台 | 第16-18页 |
| 1.4 包涵体变复性常见问题及解决手段 | 第18页 |
| 1.5 课题研究意义及工作目标 | 第18-20页 |
| 1.5.1 研究意义 | 第18-19页 |
| 1.5.2 工作目标 | 第19-20页 |
| 第2章 材料与方法 | 第20-38页 |
| 2.1 材料与仪器 | 第20-27页 |
| 2.1.1 化学药品与试剂 | 第20页 |
| 2.1.2 生物药品与试剂 | 第20-21页 |
| 2.1.3 培养基 | 第21-22页 |
| 2.1.4 缓冲液 | 第22-23页 |
| 2.1.5 菌种 | 第23-24页 |
| 2.1.6 质粒 | 第24页 |
| 2.1.7 重组质粒 | 第24-25页 |
| 2.1.8 引物 | 第25-26页 |
| 2.1.9 生物学及数学处理软件 | 第26-27页 |
| 2.2 微生物的培养与保种 | 第27页 |
| 2.2.1 微生物培养条件 | 第27页 |
| 2.2.2 菌种的保藏与活化 | 第27页 |
| 2.3 遗传学方法 | 第27-28页 |
| 2.3.1 大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备(短期用) | 第27-28页 |
| 2.3.2 大肠杆菌热激法转化 | 第28页 |
| 2.4 基因工程方法 | 第28-33页 |
| 2.4.1 大肠杆菌系质粒的抽提 | 第28-29页 |
| 2.4.2 DNA凝胶电泳 | 第29页 |
| 2.4.3 DNA的酶切反应 | 第29-30页 |
| 2.4.4 DNA的连接反应 | 第30页 |
| 2.4.5 DNA凝胶回收 | 第30页 |
| 2.4.6 DNA的沉淀回收 | 第30页 |
| 2.4.7 In-Fusion基因克隆方法 | 第30-31页 |
| 2.4.8 重叠延伸PCR法的定点突变 | 第31页 |
| 2.4.9 SDS-PAGE电泳 | 第31-33页 |
| 2.5 融合His-Tag重组蛋白的纯化 | 第33-34页 |
| 2.5.1 Ni-NTA纯化带组氨酸标签蛋白的原理 | 第33-34页 |
| 2.5.2 蛋白除盐浓缩 | 第34页 |
| 2.6 蛋白浓度的测定 | 第34-35页 |
| 2.7 海藻酸酶的测活方法 | 第35页 |
| 2.8 核磁共振技术 | 第35-36页 |
| 2.9 不溶性蛋白质的变复性 | 第36-38页 |
| 第3章 结果与分析 | 第38-70页 |
| 3.1 三种重组蛋白的底物特异性差异 | 第38-39页 |
| 3.1.1 AlgV1-S、AlgV2-及AlgV3-S的克隆 | 第38页 |
| 3.1.2 AlgV1-S、AlgV2-及AlgV3-S的PCR反应体系 | 第38-39页 |
| 3.2 T7启动子介导的重组表达质粒构建 | 第39-41页 |
| 3.3 重组表达质粒的蛋白检测与纯化 | 第41-43页 |
| 3.3.1 AlgV1-S、AlgV2-S、AlgV3-S重组质粒的蛋白表达及SDS-PAGE检测 | 第41-42页 |
| 3.3.2 AlgV1-S、AlgV2-S、AlgV3-S重组蛋白的镍柱纯化 | 第42-43页 |
| 3.4 三种重组蛋白的底物特异性差异 | 第43-50页 |
| 3.4.1 TBA法测定AlgV1-S、AlgV2-S、AlgV3-S对不同类型底物的酶活 | 第43-44页 |
| 3.4.2 重组蛋白AlgV1-S、AlgV2-S、AlgV3-S对不同底物降解的产物鉴定 | 第44-49页 |
| 3.4.3 三种海藻酸裂解酶不同配比对海藻酸钠降解深度影响的研究 | 第49-50页 |
| 3.5 三种重组蛋白的催化部位结构差异 | 第50-65页 |
| 3.5.1 存在于催化中心的重要氨基酸的确定及个别高效酶的获得 | 第50-59页 |
| 3.5.2 不同类型的组合酶的催化差异性 | 第59-65页 |
| 3.6 重组蛋白AlgV1-S、AlgV2-S、AlgV3-S的表观酶学性质差异 | 第65-70页 |
| 3.6.1 测活方法：DNS法及TBA法的结合 | 第65-66页 |
| 3.6.2 不同缓冲液,pH及不同反应温度对重组酶活性的影响 | 第66-67页 |
| 3.6.3 多肽融合标签His6-Tag对目标蛋白影响的初步研究 | 第67-70页 |
| 第4章 研究总结与讨论 | 第70-78页 |
| 4.1 重要研究结论 | 第70-71页 |
| 4.2 分析及讨论 | 第71-78页 |
| 4.2.1 底物特异性分析及含量估算 | 第71页 |
| 4.2.2 催化差异显示及值得深入探究的内容 | 第71-72页 |
| 4.2.3 胞内裂解酶algV4与algV5 | 第72-73页 |
| 4.2.4 蛋白质的分子设计和实验进化 | 第73-75页 |
| 4.2.5 包涵体表达蛋白实现可溶性的另一条思路 | 第75-76页 |
| 4.2.6 蛋白质精细三维结构的分析 | 第76-78页 |
| 第5章 课题展望 | 第78-79页 |
| 第6章 致谢 | 第79-80页 |
| 参考文献 | 第80-84页 |
