| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 1 引言 | 第9-17页 |
| 1.1 结构与功能 | 第9-10页 |
| 1.2 ACTH激活的细胞信号过程 | 第10-12页 |
| 1.2.1 黑素皮质素受体MCR家族 | 第10-12页 |
| 1.2.2 ACTH激活的细胞信号转导 | 第12页 |
| 1.3 糖皮质激素的合成 | 第12-14页 |
| 1.4 基因重组融合蛋白 | 第14-15页 |
| 1.5 ACTH的应用及研究 | 第15-16页 |
| 1.6 研究目的和意义 | 第16页 |
| 1.7 技术路线 | 第16-17页 |
| 2 材料与方法 | 第17-36页 |
| 2.1 实验材料与试剂 | 第17-18页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第17-18页 |
| 2.1.2 实验试剂 | 第18页 |
| 2.2 载体构建 | 第18-23页 |
| 2.2.1 人ACTH CDS序列的优化及合成 | 第18页 |
| 2.2.2 ACTH突变体的设计 | 第18-19页 |
| 2.2.3 ACTH野生型及其突变体载体的构建 | 第19-23页 |
| 2.3 蛋白纯化 | 第23-30页 |
| 2.3.1 重组质粒的表达 | 第23页 |
| 2.3.2 工程菌的破碎 | 第23-24页 |
| 2.3.3 Ni柱纯化 | 第24-26页 |
| 2.3.4 肠激酶酶切 | 第26-28页 |
| 2.3.5 CM弱阳离子柱层析纯化 | 第28-30页 |
| 2.4 不同ACTH在小鼠血液中的代谢速度分析及生物学活性测定 | 第30-31页 |
| 2.4.1 各种ACTH在小鼠血液中的代谢速度分析 | 第30-31页 |
| 2.4.2 各种ACTH在小鼠血液中的生物活性测定 | 第31页 |
| 2.5 不同ACTH在小鼠Y1细胞系中的生物学活性分析 | 第31-36页 |
| 2.5.1 不同ACTH刺激Y1细胞后的生物活性分析 | 第31-32页 |
| 2.5.2 不同ACTH刺激Y1细胞后cAMP和磷酸化CREB的变化检测 | 第32-33页 |
| 2.5.3 不同ACTH刺激Y1细胞后对合成糖皮质激素关键基因转录水平的影响 | 第33-36页 |
| 3 结果与分析 | 第36-46页 |
| 3.1 ACTH重组质粒的构建 | 第36-37页 |
| 3.2 ACTH重组蛋白的纯化 | 第37-40页 |
| 3.2.1 Ni柱纯化 | 第37页 |
| 3.2.2 肠激酶酶切 | 第37-38页 |
| 3.2.3 CM阳离子交换柱纯化 | 第38-40页 |
| 3.3 ACTH野生型和突变体在小鼠体内的生理活性比较 | 第40页 |
| 3.4 ACTH野生型和突变体在小鼠体内的代谢速率比较 | 第40-41页 |
| 3.5 ACTH野生型和突变体在体外培养的小鼠皮质瘤Y1细胞中生理活性比较 | 第41-42页 |
| 3.6 ACTH野生型(WT)和突变体(E5D、Y2S)对Y1细胞的PKA通路中关键细胞因子的影响 | 第42-44页 |
| 3.6.1 ACTH野生型和突变体对小鼠肾上腺皮质Y1细胞中的cAMP浓度影响 | 第42-43页 |
| 3.6.2 ACTH野生型和突变体对小鼠肾上腺皮质Y1细胞中的磷酸化CREB浓度影响比较 | 第43-44页 |
| 3.7 ACTH野生型(WT)和突变体(E5D、Y2S)刺激在体外培养的小鼠皮质瘤Y1细胞中合成糖皮质激素关键基因转录水平比较 | 第44-46页 |
| 4 讨论 | 第46-49页 |
| 4.1 基因重组长效ACTH表达体系的构建 | 第46页 |
| 4.2 ACTH的分离纯化 | 第46-47页 |
| 4.3 ACTH长效型突变体筛选 | 第47-49页 |
| 5 结论 | 第49-50页 |
| 参考文献 | 第50-60页 |
| 缩略语表 | 第60-62页 |
| 附录 | 第62-66页 |
| 致谢 | 第66页 |
