| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第一章 绪论 | 第13-29页 |
| 1.1 2-氨基丁酸的性质 | 第13-14页 |
| 1.2 2-氨基丁酸的不同的旋光构型 | 第14-15页 |
| 1.3 2-氨基丁酸的衍生物 | 第15-16页 |
| 1.3.1 2-氨基丁酰胺 | 第15-16页 |
| 1.3.2 2-氨基丁醇 | 第16页 |
| 1.4 2-氨基丁酸的衍生物药品 | 第16-17页 |
| 1.4.1 左乙拉西坦 | 第17页 |
| 1.4.2 布瓦西坦 | 第17页 |
| 1.4.3 乙拉西坦 | 第17页 |
| 1.4.4 乙胺丁醇 | 第17页 |
| 1.5 2-氨基丁酸的制备 | 第17-22页 |
| 1.5.1 化学法制备AABA | 第17-19页 |
| 1.5.1.1 化学合成法 | 第18页 |
| 1.5.1.2 化学拆分法 | 第18-19页 |
| 1.5.2 生物发酵法制备AABA | 第19页 |
| 1.5.3 生物酶法制备AABA | 第19-22页 |
| 1.5.3.1 生物酶拆分法 | 第19-20页 |
| 1.5.3.2 生物酶转化法 | 第20-22页 |
| 1.6 AABA的分离纯化 | 第22-23页 |
| 1.7 AABA合成酶体系 | 第23-25页 |
| 1.7.1 苏氨酸脱氨酶 | 第23-24页 |
| 1.7.2 脱氨酶体系 | 第24页 |
| 1.7.2.1 亮氨酸脱氨酶 | 第24页 |
| 1.7.2.2 甲酸脱氢酶 | 第24页 |
| 1.7.3 转氨酶体系 | 第24-25页 |
| 1.7.3.1 转氨酶TA | 第24-25页 |
| 1.7.3.2 ω-转氨酶 | 第25页 |
| 1.8 大肠杆菌原核表达系统 | 第25-26页 |
| 1.9 sf-GFP | 第26-27页 |
| 1.10 AABA测定方法 | 第27-28页 |
| 1.10.1 薄层层析法 | 第27页 |
| 1.10.2 高效液相色谱法 | 第27-28页 |
| 1.11 本研究的目的及意义 | 第28-29页 |
| 第二章 材料与方法 | 第29-43页 |
| 2.1 材料 | 第29-34页 |
| 2.1.1 质粒与菌株 | 第29-30页 |
| 2.1.2 仪器设备 | 第30页 |
| 2.1.3 试剂 | 第30页 |
| 2.1.4 培养基配置 | 第30-31页 |
| 2.1.5 本研究主要使用的溶液配制 | 第31-34页 |
| 2.1.5.1 常用的试剂配置 | 第31-32页 |
| 2.1.5.2 琼脂糖凝胶电泳试剂的配置 | 第32页 |
| 2.1.5.3 SDS-PAGE电泳缓冲液配制 | 第32-33页 |
| 2.1.5.4 蛋白质印迹缓冲液 | 第33页 |
| 2.1.5.5 碱裂解法小量提取质粒DNA试剂的配制 | 第33页 |
| 2.1.5.6 其它试剂药品 | 第33-34页 |
| 2.2.方法 | 第34-43页 |
| 2.2.1 全基因合成路线 | 第34-36页 |
| 2.2.1.1 目的基因的引物设计 | 第34页 |
| 2.2.1.2 引物退火 | 第34-35页 |
| 2.2.1.3 LIC-A载体制备 | 第35页 |
| 2.2.1.4 表达载体PET23a的制备 | 第35-36页 |
| 2.2.1.5 拼接片段的克隆 | 第36页 |
| 2.2.2 Inoue法制备大肠杆菌感受态及转化 | 第36-37页 |
| 2.2.2.1 感受态菌株的活化 | 第36页 |
| 2.2.2.2 感受态细胞的制作 | 第36-37页 |
| 2.2.2.3 感受态细胞的转化 | 第37页 |
| 2.2.2.4 转化子的筛选 | 第37页 |
| 2.2.3 小片段拼接克隆到表达载体 | 第37-38页 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳回收DNA片段 | 第38-39页 |
| 2.2.5 小量抽提质粒DNA | 第39页 |
| 2.2.6 重组蛋白的表达 | 第39-40页 |
| 2.2.6.1 重组蛋白的表达 | 第39页 |
| 2.2.6.2 聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳 | 第39-40页 |
| 2.2.6.3 Western-Blot检测重组蛋白的表达 | 第40页 |
| 2.2.7 酶活性测定 | 第40-41页 |
| 2.2.7.1 TD酶活性测定 | 第40-41页 |
| 2.2.7.2 S-TA酶活性测定 | 第41页 |
| 2.2.7.3 茚三酮衍生化薄层层析 | 第41页 |
| 2.2.8 AABA柱前衍生化 | 第41-42页 |
| 2.2.9 AABA的HPLC定量检测 | 第42-43页 |
| 第三章 结果与分析 | 第43-49页 |
| 3.1 TD和S-ω-TA的全基因合成 | 第43页 |
| 3.1.1 引物设计 | 第43页 |
| 3.1.2 全长基因拼接 | 第43页 |
| 3.2 重组酶TD和S-ω-TA的表达 | 第43-44页 |
| 3.2.1 SDS-PAGE分析重组酶的表达情况 | 第44页 |
| 3.2.2 Western blot验证TD和S-ω-TA的表达 | 第44页 |
| 3.3 全细胞催化不对称合成AABA条件 | 第44-46页 |
| 3.3.1 茚三酮衍生化薄层层析检测法 | 第44-46页 |
| 3.3.1.1 展层剂的成分的确定 | 第44-45页 |
| 3.3.1.2 L-Thr底物浓度的确定 | 第45-46页 |
| 3.4 AABA重结晶 | 第46页 |
| 3.5 LC-MS鉴定AABA | 第46页 |
| 3.6 HPLC定量检测AABA | 第46-49页 |
| 第四章 讨论与展望 | 第49-50页 |
| 4.1 讨论 | 第49页 |
| 4.2 展望 | 第49-50页 |
| 结论 | 第50-51页 |
| 参考文献 | 第51-55页 |
| 致谢 | 第55页 |
