| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-14页 |
| 第一章 引言 | 第14-25页 |
| ·鸡马立克氏病病毒研究概述 | 第14-18页 |
| ·鸡马立克氏病简介 | 第14页 |
| ·病毒的进化 | 第14-16页 |
| ·MDV 转化和肿瘤的形成 | 第16页 |
| ·病毒相关的糖蛋白基因和抗MD 的研究 | 第16-18页 |
| ·预防MDV 的策略 | 第18页 |
| ·RNAi 技术研究进展 | 第18-23页 |
| ·RNAi 的概述及作用原理 | 第18-20页 |
| ·合成性siRNA 介导的RNAi | 第20页 |
| ·载体介导的RNAi | 第20-21页 |
| ·RNAi 载体的转运体系 | 第21-22页 |
| ·RNAi 的应用和局限性 | 第22-23页 |
| ·RNAi 介导的抗MD 研究的前景 | 第23页 |
| ·本文的研究目的和意义 | 第23-25页 |
| 第二章 MDV gI/gE 基因有效siRNA 的筛选及U6 启动子的活性比较 | 第25-42页 |
| ·材料 | 第25-26页 |
| ·工程菌、细胞、质粒及毒株 | 第25-26页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第26页 |
| ·方法 | 第26-33页 |
| ·引物设计与合成 | 第26-27页 |
| ·重叠PCR 扩增法制备带发夹结构的shRNA 表达盒 | 第27-29页 |
| ·表达gI-EGFP 和gE-EGFP 融合基因的报告质粒构建 | 第29-31页 |
| ·不同细胞系稳定抑制试验 | 第31页 |
| ·不同来源的U6 启动子驱动siRNAs 的转录活性比较 | 第31-33页 |
| ·结果 | 第33-39页 |
| ·重叠PCR 法扩增cU6-3-shRNA 表达盒 | 第33页 |
| ·gI-EGFP 和gE-EGFP 融合基因报告质粒的鉴定 | 第33-34页 |
| ·cU6-3-shRNA 抑制gE -EGFP、gI-EGFP 融合蛋白的表达 | 第34-35页 |
| ·细胞系稳定抑制试验结果 | 第35-36页 |
| ·不同的启动子驱动siRNAs 的效果评价 | 第36-39页 |
| ·讨论 | 第39-42页 |
| ·重叠PCR 法合成shRNA 表达盒 | 第39-40页 |
| ·高效siRNAs 的筛选原则 | 第40页 |
| ·禽源U6 和鼠源U6 在不同细胞中表达siRNAs 的效率 | 第40-42页 |
| 第三章 MDV 特异shRNA 的表达载体的构建及其抑制效果的评价 | 第42-57页 |
| ·材料 | 第42-44页 |
| ·质粒、工程菌和毒株 | 第42-43页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第43-44页 |
| ·方法 | 第44-49页 |
| ·引物设计与合成 | 第44页 |
| ·串联表达载体pEU6 -shgE936-shgI735 的构建 | 第44-45页 |
| ·shRNA 重组质粒载体pEU6-shgI735 和pEU6- shgE936 的构建 | 第45-46页 |
| ·shRNA 表达载体CEF 上的表达及转录水平检测 | 第46页 |
| ·半定量RT-PCR 法检测特异性shRNA 表达载体抑制MDV 糖蛋白基因的表达 | 第46-47页 |
| ·特异性shRNA 表达载体抑制MDV 蚀斑的形成 | 第47-48页 |
| ·MTT 细胞毒性试验 | 第48-49页 |
| ·结果 | 第49-55页 |
| ·串联表达载体pEU6-shgE936-shgI735 的鉴定 | 第49-50页 |
| ·pEU6-shgI735 和pEU6- shgE936 重组质粒鉴定 | 第50页 |
| ·shRNA 表达载体在CEF 细胞上的表达及RT-PCR 检测 | 第50-51页 |
| ·半定量RT-PCR 法检测MDV 感染细胞中糖蛋白基因的表达 | 第51-52页 |
| ·抑制病毒蚀斑的形成试验 | 第52-54页 |
| ·shRNA 表达载体对MDV 感染CEF 细胞的存活率的影响 | 第54-55页 |
| ·讨论 | 第55-57页 |
| ·RNA 聚合酶Ⅲ介导的shRNA 表达载体抑制MDV 复制 | 第55-56页 |
| ·shRNA 高效表达影响因素分析 | 第56-57页 |
| 第四章 结论 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-66页 |
| 致谢 | 第66-67页 |
| 作者简历 | 第67页 |
