| 摘要 | 第6-8页 |
| abstract | 第8-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-34页 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展 | 第14-23页 |
| 1.1.1 概述 | 第14-15页 |
| 1.1.2 PRRSV的分类 | 第15页 |
| 1.1.3 PRRSV的基因组结构及其编码蛋白的功能 | 第15-17页 |
| 1.1.4 PRRSV的致病机制 | 第17页 |
| 1.1.5 PRRSV免疫学研究进展 | 第17-21页 |
| 1.1.5.1 固有免疫应答 | 第17-19页 |
| 1.1.5.2 体液免疫应答 | 第19-20页 |
| 1.1.5.3 细胞免疫应答 | 第20-21页 |
| 1.1.6 PRRSV的诊断 | 第21-22页 |
| 1.1.6.1 临床症状和病理变化 | 第21页 |
| 1.1.6.2 实验室诊断 | 第21-22页 |
| 1.1.7 PRRSV的防治与疫苗研究进展 | 第22-23页 |
| 1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒的流行及传播 | 第23-24页 |
| 1.3 免疫网络调节与抗独特型抗体 | 第24-25页 |
| 1.4 单链抗体 | 第25-26页 |
| 1.5 猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体研究进展 | 第26-34页 |
| 1.5.1 硫酸乙酰肝素（HS） | 第26页 |
| 1.5.2 唾液酸粘附素 （Sn） | 第26-27页 |
| 1.5.3 CD163分子 | 第27-29页 |
| 1.5.4 CD151分子 | 第29-31页 |
| 1.5.5 波形蛋白 (Vimentin) | 第31-34页 |
| 第二章 本研究工作的目的和意义 | 第34-36页 |
| 2.1 研究背景 | 第34页 |
| 2.2 研究目的和意义 | 第34-36页 |
| 第三章 单链可变区抗体的克隆及真核表达载体的构建 | 第36-52页 |
| 3.1 试验材料 | 第36-37页 |
| 3.1.1 细胞和菌株 | 第36页 |
| 3.1.2 主要试剂及载体 | 第36-37页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第37页 |
| 3.1.4 主要试剂配制 | 第37页 |
| 3.2 试验方法 | 第37-47页 |
| 3.2.1 杂交瘤细胞的复苏、培养和冻存 | 第37-38页 |
| 3.2.2 Mab2‐5G2杂交瘤细胞总RNA的提取 | 第38页 |
| 3.2.3 VH和VL cDNA的扩增与序列分析 | 第38-40页 |
| 3.2.3.1 RT‐PCR | 第39页 |
| 3.2.3.2 VH和VL PCR产物回收及序列比对 | 第39-40页 |
| 3.2.4 5G2scFv的构建与序列分析 | 第40-42页 |
| 3.2.5 融合表达EGFP的 5G2scFv真核表达载体的设计 | 第42-47页 |
| 3.2.5.1 构建融合表达EGFP的 5G2scFv | 第42-44页 |
| 3.2.5.2 融合表达scFv和EGFP的真核表达载体的构建 | 第44-47页 |
| 3.3 试验结果 | 第47-50页 |
| 3.3.1 VH和VL的PCR扩增结果与序列分析 | 第47页 |
| 3.3.2 全长 5G2scFv的PCR扩增结果与序列分析 | 第47-49页 |
| 3.3.3 pTRIP‐CMV‐5G2scFv‐EGFP/pTRIP‐CMV‐1B5scFv‐EGFP‐Puro载体的构建 | 第49-50页 |
| 3.3.3.15G2scFv‐EGFP扩增结果及鉴定 | 第49页 |
| 3.3.3.2 真核表达载体pTRIP‐CMV‐5G2scFv‐EGFP和pTRIP‐CMV‐1B5scFv‐ ‐EGFP‐Puro的构建及鉴定 | 第49-50页 |
| 3.4 讨论 | 第50-51页 |
| 3.4.1 关于scFv中VH和VL之间弹性连接子（Flexial Linker）的选择 | 第50页 |
| 3.4.2 关于在 5G2scFv和EGFP之间GPGP连接子的选择 | 第50-51页 |
| 3.5 小结 | 第51-52页 |
| 第四章 稳定表达 5G2scFv-EGFP和 1B5scFv-EGFP的MARC-145细胞系的建立 | 第52-65页 |
| 4.1 试验材料 | 第52-53页 |
| 4.1.1 细胞和质粒 | 第52页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第52-53页 |
| 4.1.3 主要仪器 | 第53页 |
| 4.2 试验方法 | 第53-58页 |
| 4.2.1 嘌呤霉素对MARC‐145细胞最小致死浓度的测定 | 第53页 |
| 4.2.2 重组慢病毒的包装 | 第53页 |
| 4.2.3 表达 5G2scFv/1B5scFv慢病毒的转导和细胞系的筛选 | 第53-54页 |
| 4.2.3.1 表达 5G2scFv/1B5scFv慢病毒转导MARC‐145 | 第53-54页 |
| 4.2.3.2 转导细胞系的筛选 | 第54页 |
| 4.2.4 稳定表达 5G2scFv‐EGFP和 1B5scFv‐EGFP细胞系的鉴定 | 第54-57页 |
| 4.2.4.1 RT‐PCR检测 5G2scFv/1B5scFv基因的表达 | 第54页 |
| 4.2.4.2 间接免疫荧光试验鉴定 5G2scFv的表达 | 第54-55页 |
| 4.2.4.3 Western blot检测筛选细胞系中scFv的表达 | 第55-57页 |
| 4.2.5 5G2scFv表达对细胞生长的影响 | 第57-58页 |
| 4.2.5.1 标准曲线的制备 | 第57-58页 |
| 4.2.5.2 生长曲线的测定 | 第58页 |
| 4.3 试验结果 | 第58-62页 |
| 4.3.1 嘌呤霉素对MARC‐145细胞最小致死浓度的确定 | 第58页 |
| 4.3.2 稳定表达 5G2scFv和 1B5scFv的细胞系的筛选 | 第58-59页 |
| 4.3.3 稳定表达 5G2scFv和 1B5scFv细胞系的建立及鉴定 | 第59-61页 |
| 4.3.3.1 RT‐PCR检测 5G2scFv基因的表达 | 第59-60页 |
| 4.3.3.2 间接免疫荧光试验鉴定 5G2scFv及 1B5scFv的表达 | 第60页 |
| 4.3.3.3 Western blot鉴定筛选细胞系中scFv的表达 | 第60-61页 |
| 4.3.45G2scFv胞内表达对细胞生长的影响 | 第61-62页 |
| 4.3.4.1 标准曲线构建 | 第61-62页 |
| 4.3.4.2 生长曲线构建 | 第62页 |
| 4.4 讨论 | 第62-64页 |
| 4.4.1 选择慢病毒载体系统的原因 | 第62-63页 |
| 4.4.2 表达scFv的细胞系筛选及其表达对细胞生长的影响 | 第63页 |
| 4.4.3 稳定表达 5G2scFv的细胞系的鉴定 | 第63-64页 |
| 4.5 小结 | 第64-65页 |
| 第五章 MARC-145细胞内稳定表达 5G2scFv对PRRSV感染的影响 | 第65-75页 |
| 5.1 试验材料 | 第65-66页 |
| 5.1.1 细胞和病毒 | 第65页 |
| 5.1.2 主要试剂 | 第65页 |
| 5.1.3 主要仪器 | 第65-66页 |
| 5.2 试验方法 | 第66-69页 |
| 5.2.1 稳定表达 5G2scFv的MARC‐145细胞对不同PRRSV毒株感染的影响 | 第66-67页 |
| 5.2.1.1 不同毒株在MARC‐5G2scFv细胞中的增殖情况 | 第66页 |
| 5.2.1.2 间接免疫荧光检测不同剂量SD16在MARC‐5G2scFv细胞中的增殖 | 第66-67页 |
| 5.2.25G2scFv胞内表达后对子代病毒产生的影响 | 第67页 |
| 5.2.3 MARC‐145细胞内稳定表达 5G2scFv对PRRSV吸附的影响 | 第67-69页 |
| 5.2.3.1 荧光定量RT‐PCR检测MARC‐5G2scFv细胞系对PRRSV吸附的影响 | 第67-68页 |
| 5.2.3.2 TCID50检测MARC‐145细胞内表达 5G2scFv后对PRRSV吸附的影响 | 第68-69页 |
| 5.3 试验结果 | 第69-73页 |
| 5.3.1MARC‐145细胞内稳定表达 5G2scFv对PRRSV增殖的影响 | 第69-71页 |
| 5.3.1.1 不同毒株PRRSV在MARC‐5G2scFv细胞中的增殖 | 第69-70页 |
| 5.3.1.2 不同浓度SD16在MARC‐5G2scFv细胞中的增殖 | 第70-71页 |
| 5.3.2 MARC‐145细胞内表达 5G2scFv后病毒的生长动力学曲线检测 | 第71页 |
| 5.3.3 MARC‐145细胞内稳定表达 5G2scFv细胞对PRRSV吸附的影响 | 第71-73页 |
| 5.3.3.1 荧光定量PCR检测胞内表达 5G2scFv对病毒吸附的影响 | 第71-72页 |
| 5.3.3.2 TCID50检测胞内表达 5G2scFv对PRRSV吸附的影响 | 第72-73页 |
| 5.4 讨论 | 第73-74页 |
| 5.4.15G2scFv胞内表达抑制PRRSV在MARC‐145细胞中的增殖 | 第73页 |
| 5.4.2 胞内表达 5G2scFv不影响PRRSV吸附MARC‐145细胞 | 第73-74页 |
| 5.5 小结 | 第74-75页 |
| 第六章 胞内表达 5G2scFv上调IFN-α 抑制PRRSV增殖 | 第75-80页 |
| 6.1 材料 | 第75页 |
| 6.1.1 细胞和病毒 | 第75页 |
| 6.1.2 试剂和仪器 | 第75页 |
| 6.2 方法 | 第75-77页 |
| 6.2.1 荧光定量RT‐PCR检测IFN‐α 和IFN‐β 转录水平变化 | 第75-76页 |
| 6.2.2 ELISA检测IFN‐α 和IFN‐β 蛋白水平变化 | 第76-77页 |
| 6.2.2.1 绘制标准曲线 | 第76-77页 |
| 6.2.2.2 ELISA法检测IFN‐α 和IFN‐β 浓度 | 第77页 |
| 6.3 结果与分析 | 第77-78页 |
| 6.3.1 荧光定量RT‐PCR检测IFN‐α 和IFN‐β 转录水平变化 | 第77-78页 |
| 6.3.2 ELISA检测IFN‐α 和IFN‐β 蛋白水平变化 | 第78页 |
| 6.4 讨论 | 第78-79页 |
| 6.5 小结 | 第79-80页 |
| 全文总结 | 第80-81页 |
| 论文创新点和进一步研究课题 | 第81-82页 |
| 创新点 | 第81页 |
| 下一步研究方向 | 第81-82页 |
| 参考文献 | 第82-96页 |
| 致谢 | 第96-97页 |
| 作者简介 | 第97页 |
