| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 缩略词表 | 第14-16页 |
| 第一章 引言 | 第16-33页 |
| 1.1 抗病毒先天性免疫 | 第16-21页 |
| 1.1.1 病毒诱导Ⅰ型干扰素产生信号通路 | 第16-18页 |
| 1.1.2 Ⅰ型干扰素介导抗病毒作用 | 第18-19页 |
| 1.1.3 Ⅰ型干扰素的信号转导 | 第19-21页 |
| 1.2 先天性免疫中的泛素化与去泛素化修饰 | 第21-26页 |
| 1.2.1 泛素化修饰简介 | 第21页 |
| 1.2.2 泛素化修饰参与调控先天性免疫 | 第21-23页 |
| 1.2.3 去泛素化酶 | 第23-24页 |
| 1.2.4 去泛素化酶参与调控先天性免疫 | 第24-26页 |
| 1.3 病毒与泛素化修饰 | 第26-28页 |
| 1.3.1 泛素蛋白酶体途径参与病毒复制 | 第26-27页 |
| 1.3.2 病毒蛋白的泛素化修饰 | 第27页 |
| 1.3.3 病毒蛋白参与调控先天性免疫信号通路中的泛素化修饰 | 第27-28页 |
| 1.4 抑癌基因GLTSCR2的功能研究 | 第28-30页 |
| 1.4.1 GLTSCR2的发现 | 第28页 |
| 1.4.2 GLTSCR2的细胞功能研究 | 第28-30页 |
| 1.5 目的与意义 | 第30页 |
| 1.6 研究内容与技术路线 | 第30-33页 |
| 1.6.1 研究目标、研究内容 | 第30-31页 |
| 1.6.2 技术路线 | 第31-33页 |
| 第二章 细胞蛋白GLTSCR2调控多种病毒的复制 | 第33-55页 |
| 2.1 引言 | 第33页 |
| 2.2 材料 | 第33-38页 |
| 2.2.1 细胞、病毒和质粒 | 第33-34页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第34-35页 |
| 2.2.3 主要仪器 | 第35-36页 |
| 2.2.4 细胞培养所需试剂(主要参考分子克隆试验指南) | 第36页 |
| 2.2.5 Western Blot试验相关试剂 | 第36-37页 |
| 2.2.6 细菌培养基 | 第37页 |
| 2.2.7 PCR引物和RNAi序列 | 第37-38页 |
| 2.3 方法 | 第38-45页 |
| 2.3.1 RNA的提取及反转录 | 第38页 |
| 2.3.2 PCR扩增 | 第38-39页 |
| 2.3.3 PCR产物的回收 | 第39页 |
| 2.3.4 目的片段与载体的双酶切 | 第39页 |
| 2.3.5 DNA片段的连接 | 第39-40页 |
| 2.3.6 连接产物的转化 | 第40页 |
| 2.3.7 小提质粒 | 第40-41页 |
| 2.3.8 鸡胚接种、成纤维细胞的制备及病毒毒力的测定 | 第41-42页 |
| 2.3.9 细胞的复苏、传代和冻存 | 第42-43页 |
| 2.3.10 重组质粒的转染 | 第43页 |
| 2.3.11 荧光定量PCR检测GLTSCR2对病毒RNA水平的影响 | 第43页 |
| 2.3.12 病毒TCID50测定 | 第43-44页 |
| 2.3.13 细胞收取与免疫印迹检测 | 第44-45页 |
| 2.3.14 GLTSCR2全长与截短体细胞定位的观察 | 第45页 |
| 2.3.15 统计分析 | 第45页 |
| 2.4 结果 | 第45-53页 |
| 2.4.1 细胞蛋白GLTSCR2影响多种病毒的复制 | 第45-49页 |
| 2.4.2 GLTSCR2出核缺失突变体对病毒复制的影响 | 第49页 |
| 2.4.3 病毒感染对GLTSCR2细胞特性的影响 | 第49-53页 |
| 2.5 讨论 | 第53-54页 |
| 2.6 小结 | 第54-55页 |
| 第三章 GLTSCR2负调控Ⅰ型干扰素的产生与抗病毒应答 | 第55-74页 |
| 3.1 引言 | 第55页 |
| 3.2 材料 | 第55-58页 |
| 3.2.1 细胞、毒种和质粒 | 第55页 |
| 3.2.2 试剂 | 第55-57页 |
| 3.2.3 主要仪器设备 | 第57页 |
| 3.2.4 PCR引物和RNAi序列 | 第57-58页 |
| 3.3 方法 | 第58-64页 |
| 3.3.1 重组质粒的构建 | 第58-59页 |
| 3.3.2 双荧光素酶报告基因试验检测GLTSCR2对Ⅰ型干扰素的影响 | 第59页 |
| 3.3.3 pEGFP-N1-GLTSCR2转染质粒的剂量依赖性试验 | 第59-60页 |
| 3.3.4 慢病毒包装 | 第60-61页 |
| 3.3.5 免疫共沉淀试验验证GLTSCR2与RIG-Ⅰ的相互作用 | 第61-62页 |
| 3.3.6 GLTSCR2与RIG-Ⅰ相互作用区域的确定 | 第62页 |
| 3.3.7 内源性RIG-Ⅰ免疫沉淀试验 | 第62页 |
| 3.3.8 重组质粒(pFlag-cmv-GLTSCR2)的转染对IRF3磷酸化的影响 | 第62-63页 |
| 3.3.9 ELISA测定IFN-β蛋白 | 第63-64页 |
| 3.4 结果 | 第64-72页 |
| 3.4.1 GLTSCR2过表达显著下调IFN-β与NF-κB的转录 | 第64-65页 |
| 3.4.2 GLTSCR2基因沉默显著上调IFN-β的转录与表达 | 第65-66页 |
| 3.4.3 GLTSCR2靶向RIG-Ⅰ负调控Ⅰ型干扰素的活化 | 第66-69页 |
| 3.4.4 免疫沉淀试验验证GLTSCR2与RIG-Ⅰ的相互作用 | 第69-71页 |
| 3.4.5 GLTSCR2对IRF3磷酸化水平抗病毒反应的影响 | 第71-72页 |
| 3.5 讨论 | 第72-73页 |
| 3.6 小结 | 第73-74页 |
| 第四章 GLTSCR2通过USP15去泛素化RIG-Ⅰ负调控Ⅰ型干扰素的产生 | 第74-89页 |
| 4.1 引言 | 第74页 |
| 4.2 材料 | 第74-77页 |
| 4.2.1 细胞和毒种 | 第74-75页 |
| 4.2.2 试剂 | 第75-76页 |
| 4.2.3 主要仪器设备 | 第76-77页 |
| 4.2.4 PCR引物和RNAi序列 | 第77页 |
| 4.3 方法 | 第77-80页 |
| 4.3.1 重组质粒的构建 | 第77-78页 |
| 4.3.2 免疫共沉淀试验验证GLTSCR2与USP15的相互作用 | 第78页 |
| 4.3.3 GLTSCR2与USP15相互作用区域的确定 | 第78页 |
| 4.3.4 Western blot检测 | 第78-80页 |
| 4.4 结果 | 第80-86页 |
| 4.4.1 GLTSCR2对RIG-Ⅰ磷酸化或泛素化突变体诱导IFN-β活化的影响 | 第80-81页 |
| 4.4.2 GLTSCR2通去K63位去泛素化调控RIG-Ⅰ | 第81-82页 |
| 4.4.3 免疫共沉淀试验验证GLTSCR2与USP15的相互作用 | 第82页 |
| 4.4.4 免疫共沉淀验证GLT与USP15互作的作用域 | 第82-83页 |
| 4.4.5 USP15介导GLTSCR2去泛素化RIG-Ⅰ | 第83-85页 |
| 4.4.6 Trim25、USP3或USP21不参与GLTSCR2对RIG-Ⅰ泛素化的影响 | 第85-86页 |
| 4.5 讨论 | 第86-88页 |
| 4.6 小结 | 第88-89页 |
| 第五章 原核表达G4-TAT优化病毒复制 | 第89-100页 |
| 5.1 引言 | 第89页 |
| 5.2 材料 | 第89-92页 |
| 5.2.1 细胞、病毒和质粒 | 第89页 |
| 5.2.2 主要试剂 | 第89-91页 |
| 5.2.3 主要仪器 | 第91页 |
| 5.2.4 细胞培养所需试剂(主要参考分子克隆试验指南) | 第91-92页 |
| 5.2.5 Western Blot试验相关试剂 | 第92页 |
| 5.2.6 细菌培养基 | 第92页 |
| 5.3 方法 | 第92-94页 |
| 5.3.1 GLTSCR2截短体蛋白G3加穿透肽TAT重组蛋白的原核表达 | 第92-93页 |
| 5.3.2 荧光定量PCR检测GLTSCR2对Ⅰ型干扰素的影响 | 第93页 |
| 5.3.3 荧光定量PCR检测GLTSCR2对病毒RNA水平的影响 | 第93-94页 |
| 5.3.4 病毒TCID50测定 | 第94页 |
| 5.3.5 细胞收取与免疫印迹检测 | 第94页 |
| 5.3.6 统计分析 | 第94页 |
| 5.4 结果 | 第94-99页 |
| 5.4.1 重组蛋白G4-TAT的表达与纯化 | 第94页 |
| 5.4.2 重组蛋白G4-TAT可形成二聚体并能穿透细胞膜进入细胞 | 第94-95页 |
| 5.4.3 重组蛋白G4-TAT可以抑制Ⅰ型干扰素信号通路 | 第95-96页 |
| 5.4.4 重组蛋白G4-TAT促进多种病毒复制 | 第96-99页 |
| 5.5 小结 | 第99-100页 |
| 第六章 结论 | 第100-101页 |
| 第七章 创新点 | 第101-102页 |
| 参考文献 | 第102-120页 |
| 致谢 | 第120-121页 |
| 作者简介 | 第121页 |
