| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-10页 |
| 缩略词表 | 第14-15页 |
| 引言 | 第15-16页 |
| 第一部分 实验研究 | 第16-58页 |
| 第一章 细胞转染条件的优化 | 第16-24页 |
| 1 材料 | 第16-17页 |
| 1.1 主要仪器设备 | 第16-17页 |
| 1.2 化学试剂与耗材 | 第17页 |
| 1.3 实验材料 | 第17页 |
| 2 方法 | 第17-19页 |
| 2.1 小鼠胎儿成纤维细胞的分离与培养 | 第17页 |
| 2.2 电穿孔法转染小鼠胎儿成纤维细胞 | 第17-19页 |
| 3 结果 | 第19-20页 |
| 3.1 MEF细胞的分离与培养 | 第19页 |
| 3.2 小鼠胎儿成纤维细胞电穿孔法转染条件的优化 | 第19-20页 |
| 4 讨论 | 第20-22页 |
| 参考文献 | 第22-24页 |
| 第二章 GRISPR/CAS9-GRNA与NOGGIN整合载体的构建 | 第24-42页 |
| 1 材料 | 第24-25页 |
| 1.1 主要仪器设备 | 第24-25页 |
| 1.2 实验试剂、耗材 | 第25页 |
| 1.3 菌种与骨架载体 | 第25页 |
| 2 实验方法 | 第25-35页 |
| 2.1 gRNA-FGF5载体构建 | 第25-30页 |
| 2.1.1 FGF5基因功能分析 | 第26页 |
| 2.1.2 靶位点的设计 | 第26页 |
| 2.1.3 gRNA各模板原件的获得 | 第26-29页 |
| 2.1.4 cas9载体的扩繁 | 第29-30页 |
| 2.2 Noggin基因定点整合载体构建 | 第30-35页 |
| 2.2.1 克隆Noggin基因 | 第30-31页 |
| 2.2.2 人源K14启动子的获得 | 第31-32页 |
| 2.2.3 克隆Noggin定点整合载体的同源臂 | 第32-34页 |
| 2.2.4 pK14-Noggin载体组装 | 第34页 |
| 2.2.5 pKI-Noggin定点整合载体的组装 | 第34-35页 |
| 3 结果 | 第35-40页 |
| 3.1 gRNA-FGF5的序列分析 | 第35页 |
| 3.2 Noggin基因的序列分析 | 第35-37页 |
| 3.3 Noggin定点整合载体的同源臂的序列分析 | 第37-38页 |
| 3.4 pK14-Noggin载体构建结果序列分析 | 第38-39页 |
| 3.5 Noggin定点整合载体pKI-Noggin的序列分析 | 第39-40页 |
| 4 讨论 | 第40-41页 |
| 参考文献 | 第41-42页 |
| 第三章 FGF5-GRNA、CAS9、NOGGIN整合载体的功能检测 | 第42-51页 |
| 1 材料 | 第42页 |
| 1.1 主要仪器设备 | 第42页 |
| 1.2 实验试剂、耗材 | 第42页 |
| 1.3 实验材料 | 第42页 |
| 2 实验方法 | 第42-46页 |
| 2.1 FGF5-gRNA、cas9切割效率检测 | 第42-45页 |
| 2.1.1 FGF5-gRNA、cas9质粒转染小鼠成纤维细胞 | 第43页 |
| 2.1.2 利用Surveyor突变检测试剂盒检测gRNAde功能和效率 | 第43-45页 |
| 2.2 利用Western-blot方法检测PK14-Noggin的功能及效率 | 第45-46页 |
| 2.2.1 pK14-Noggin转染小鼠胎儿成纤维细胞 | 第45-46页 |
| 2.2.2 Western blot检测Noggin基因的表达 | 第46页 |
| 3 结果 | 第46-48页 |
| 3.1 FGF5-gRNA、cas9转染小鼠胎儿成纤维细胞结果及敲除效率 | 第46-47页 |
| 3.2 Western blot检测转pK14-Noggin小鼠胎儿成纤维细胞 | 第47-48页 |
| 4 讨论 | 第48-49页 |
| 参考文献 | 第49-51页 |
| 第四章 FGF5基因敲除、NOGGIN基因过表达同时作用对参与于毛发生长发育相关基因表达影响的检测 | 第51-58页 |
| 1 材料 | 第51-52页 |
| 1.1 实验材料 | 第51-52页 |
| 1.2 主要仪器设备 | 第52页 |
| 2 方法 | 第52-54页 |
| 2.1 转基因小鼠胎儿成纤维细胞RNA(Total RNA)的提取 | 第52-53页 |
| 2.2 Real-time PCR引物设计检测 | 第53页 |
| 2.3 验证实时引物特异性 | 第53-54页 |
| 2.4 利用RT PCR 2~(△△α)法检测β-catenin、Vegf、Tβ4相对表达量 | 第54页 |
| 3 结果 | 第54-56页 |
| 3.1 转基因小鼠MEF细胞的总RNA提取 | 第54-55页 |
| 3.2 实时引物特异性验证结果 | 第55页 |
| 3.3 相对表达量的分析 | 第55-56页 |
| 4 讨论 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-58页 |
| 第二部分 综述部分 | 第58-68页 |
| 1 GRISPR/CAS系统介绍 | 第58-63页 |
| 1.1 GRISPR/Cas系统的发现 | 第58-59页 |
| 1.2 GRISPR/Cas系统的结构 | 第59页 |
| 1.3 GRISPR/Cas系统的分类 | 第59-60页 |
| 1.4 GRISPR/Cas系统的作用机制 | 第60-61页 |
| 1.5 GRISPR/Cas系统的进展 | 第61-62页 |
| 1.6 GRISPR/Cas系统的构建方法与突变效率检测 | 第62页 |
| 1.7 GRISPR/Cas系统的脱靶效应 | 第62-63页 |
| 2 结语 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-68页 |
| 结论 | 第68-70页 |
| 图板1 | 第70-71页 |
| 图板2 | 第71-72页 |
| 图板3 | 第72-74页 |
| 附录 | 第74-77页 |
| 致谢 | 第77页 |
