| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 符号与缩略语说明 | 第11-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-21页 |
| 1.1 L-鸟氨酸概述 | 第12-13页 |
| 1.1.1 L-鸟氨酸理化特性 | 第12页 |
| 1.1.2 L-鸟氨酸生物体代谢 | 第12-13页 |
| 1.1.3 L-鸟氨酸的功能及应用 | 第13页 |
| 1.2 L-鸟氨酸的制备方法 | 第13-15页 |
| 1.3 精氨酸酶研究进展 | 第15-17页 |
| 1.3.1 精氨酸酶概述 | 第15页 |
| 1.3.2 精氨酸酶来源 | 第15页 |
| 1.3.3 精氨酸酶催化机理 | 第15-16页 |
| 1.3.4 不同来源精氨酸酶特点 | 第16-17页 |
| 1.4 枯草芽孢杆菌简介 | 第17-19页 |
| 1.4.1 枯草芽孢杆菌表达系统 | 第17-18页 |
| 1.4.2 Cre/lox系统的无抗生素抗性基因的操作技术 | 第18-19页 |
| 1.5 立题依据和研究意义 | 第19页 |
| 1.6 研究思路与主要内容 | 第19-21页 |
| 第二章 R.pycnus精氨酸酶的分离纯化 | 第21-32页 |
| 2.1 前言 | 第21页 |
| 2.2 实验材料 | 第21-23页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第21页 |
| 2.2.2 培养基 | 第21-22页 |
| 2.2.3 主要实验试剂 | 第22页 |
| 2.2.4 主要实验仪器 | 第22页 |
| 2.2.5 主要试剂配方 | 第22-23页 |
| 2.3 实验方法 | 第23-27页 |
| 2.3.1 产精氨酸酶菌株筛选 | 第23-24页 |
| 2.3.2 精氨酸酶酶活测定 | 第24-25页 |
| 2.3.3 精氨酸酶的分离纯化 | 第25-26页 |
| 2.3.4 酶蛋白检测 | 第26-27页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第27-31页 |
| 2.4.1 L-鸟氨酸的鉴定 | 第27页 |
| 2.4.2 高精氨酸酶酶活菌株筛选 | 第27-28页 |
| 2.4.3 R. pycnus精氨酸酶的分离纯化 | 第28-31页 |
| 2.5 本章小结 | 第31-32页 |
| 第三章 R.pycnus精氨酸酶编码基因的调取 | 第32-47页 |
| 3.1 前言 | 第32页 |
| 3.2 实验材料 | 第32-34页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第32页 |
| 3.2.2 培养基 | 第32-33页 |
| 3.2.3 主要实验试剂 | 第33页 |
| 3.2.4 主要实验仪器 | 第33页 |
| 3.2.5 主要试剂配方 | 第33-34页 |
| 3.3 实验方法 | 第34-37页 |
| 3.3.1 引物设计 | 第34页 |
| 3.3.2 R. pycnus精氨酸酶基因克隆 | 第34-37页 |
| 3.3.3 R. pycnus精氨酸酶生物信息学分析 | 第37页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第37-46页 |
| 3.4.1 简并PCR | 第37-41页 |
| 3.4.2 反向PCR | 第41-42页 |
| 3.4.3 R. pycnus精氨酸酶基因的测序及拼接 | 第42-44页 |
| 3.4.4 R. pycnus精氨酸酶氨基酸序列同源性比对 | 第44-45页 |
| 3.4.5 R. pycnus精氨酸酶二级结构和三级结构预测 | 第45-46页 |
| 3.5 本章小结 | 第46-47页 |
| 第四章 R.pycnus精氨酸酶克隆表达及酶学性质研究 | 第47-61页 |
| 4.1 前言 | 第47页 |
| 4.2 实验材料 | 第47-48页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第47页 |
| 4.2.2 培养基 | 第47页 |
| 4.2.3 主要实验试剂 | 第47-48页 |
| 4.2.4 主要实验仪器 | 第48页 |
| 4.2.5 主要试剂配方 | 第48页 |
| 4.3 实验方法 | 第48-51页 |
| 4.3.1 引物设计 | 第48页 |
| 4.3.2 重组质粒pET-28a(+)-arg的构建 | 第48-49页 |
| 4.3.3 R. pycnus精氨酸酶基因在大肠杆菌中表达 | 第49页 |
| 4.3.4 重组精氨酸酶的分离纯化 | 第49-50页 |
| 4.3.5 R. pycnus精氨酸酶的酶学性质研究 | 第50页 |
| 4.3.6 L-鸟氨酸的生物转化 | 第50-51页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第51-59页 |
| 4.4.1 R. pycnus精氨酸酶基因扩增 | 第51页 |
| 4.4.2 重组质粒构建 | 第51-53页 |
| 4.4.3 重组蛋白SDS-PAGE分析 | 第53-54页 |
| 4.4.4 酶反应产物鉴定 | 第54-55页 |
| 4.4.5 金属离子对R. pycnus精氨酸酶的影响 | 第55页 |
| 4.4.6 R. pycnus精氨酸酶的最适pH和pH稳定性 | 第55-56页 |
| 4.4.7 R. pycnus精氨酸酶的最适温度和热稳定性 | 第56-57页 |
| 4.4.8 R. pycnus精氨酸酶的反应动力学常数测定 | 第57-58页 |
| 4.4.9 R. pycnus精氨酸酶转化生产L-鸟氨酸 | 第58-59页 |
| 4.5 本章小结 | 第59-61页 |
| 第五章 双酶体系制备L-鸟氨酸 | 第61-73页 |
| 5.1 前言 | 第61页 |
| 5.2 实验材料 | 第61-62页 |
| 5.2.1 菌株和质粒 | 第61页 |
| 5.2.2 培养基 | 第61页 |
| 5.2.3 主要实验试剂 | 第61-62页 |
| 5.2.4 主要实验仪器 | 第62页 |
| 5.2.5 主要试剂配方 | 第62页 |
| 5.3 实验方法 | 第62-65页 |
| 5.3.1 引物设计 | 第62页 |
| 5.3.2 重组质粒pET-22b(+)-arg的构建 | 第62-63页 |
| 5.3.3 R. pycnus精氨酸酶基因在大肠杆菌中表达 | 第63-64页 |
| 5.3.4 精氨酸酶与脲酶性质检测 | 第64-65页 |
| 5.3.5 双酶体系合成L-鸟氨酸 | 第65页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第65-72页 |
| 5.4.1 重组质粒pET-22b(+)-arg | 第65-66页 |
| 5.4.2 蛋白纯化及SDS-PAGE分析 | 第66-67页 |
| 5.4.3 pH和金属离子对酶活力影响 | 第67-69页 |
| 5.4.4 温度对酶活力的影响 | 第69-70页 |
| 5.4.5 双酶法制备L-鸟氨酸 | 第70-72页 |
| 5.5 本章小结 | 第72-73页 |
| 第六章 R.pycnus精氨酸酶在枯草芽孢杆菌中染色体整合表达 | 第73-96页 |
| 6.1 前言 | 第73-74页 |
| 6.2 实验材料 | 第74-76页 |
| 6.2.1 菌株和质粒 | 第74页 |
| 6.2.2 培养基 | 第74-75页 |
| 6.2.3 主要实验试剂 | 第75页 |
| 6.2.4 主要实验仪器 | 第75页 |
| 6.2.5 主要试剂配方 | 第75-76页 |
| 6.3 实验方法 | 第76-82页 |
| 6.3.1 引物设计 | 第76页 |
| 6.3.2 B. subtilis 168 精氨酸酶基因敲除 | 第76-78页 |
| 6.3.3 P43-arg-7S6表达单元的构建 | 第78页 |
| 6.3.4 表达单元的定点整合 | 第78-79页 |
| 6.3.5 表达单元的随机整合 | 第79-80页 |
| 6.3.6 表达单元拷贝数提高 | 第80页 |
| 6.3.7 枯草芽孢杆菌质粒表达 | 第80页 |
| 6.3.8 重组菌株性质检测 | 第80-82页 |
| 6.3.9 全细胞转化L-鸟氨酸 | 第82页 |
| 6.4 结果与讨论 | 第82-94页 |
| 6.4.1 B. subtilis 168 精氨酸酶基因敲除 | 第82-84页 |
| 6.4.2 质粒型表达菌株构建 | 第84-85页 |
| 6.4.3 整合型表达菌株构建 | 第85-91页 |
| 6.4.4 基因组重排 | 第91页 |
| 6.4.5 重组菌株发酵培养及活力分析 | 第91-93页 |
| 6.4.6 全细胞转化生产L-鸟氨酸 | 第93-94页 |
| 6.4.7 重组菌株传代稳定性 | 第94页 |
| 6.5 本章小结 | 第94-96页 |
| 主要结论与展望 | 第96-98页 |
| 论文创新点 | 第98-99页 |
| 致谢 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-107页 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第107页 |
