| 中文摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 第一章 p53突变或缺失对PDT杀伤结肠癌细胞活力的影响 | 第14-34页 |
| 1.前言 | 第14-16页 |
| 2.实验材料 | 第16-18页 |
| 2.1 细胞 | 第16页 |
| 2.2 主要的实验仪器 | 第16-17页 |
| 2.3 主要试剂 | 第17-18页 |
| 3.实验方法 | 第18-24页 |
| 3.1 细胞培养 | 第18-19页 |
| 3.2 细胞计数 | 第19页 |
| 3.3 细胞冻存 | 第19-20页 |
| 3.4 细胞复苏 | 第20页 |
| 3.5 动物模型的建立 | 第20页 |
| 3.6 光敏剂准备 | 第20-21页 |
| 3.7 实验分组 | 第21-22页 |
| 3.8 氨乙酸丙酸-光动力(ALA-PDT)治疗 | 第22页 |
| 3.9 细胞活力检测 | 第22-23页 |
| 3.10 常规使用溶液配制 | 第23页 |
| 3.11 统计学分析 | 第23-24页 |
| 4.实验结果 | 第24-31页 |
| 4.1 p53mut和p53wt结肠癌细胞株PDT处理后细胞活力的比较 | 第24-25页 |
| 4.2 结肠癌HT29和RKO细胞PDT处理后相对活力的比较 | 第25页 |
| 4.3 p53~(-/-)和p53~(+/+) HCT116细胞PDT处理后相对活力的比较 | 第25-26页 |
| 4.4 HT29和RKO细胞裸鼠成瘤及PDT处理后肿瘤体积的比较 | 第26-27页 |
| 4.5 HT29和RKO细胞裸鼠成瘤及PDT处理后裸鼠生存期的比较 | 第27-28页 |
| 4.6 p53~(-/-)和p53~(+/+) HCT116细胞裸鼠成瘤及PDT处理后肿瘤体积的比较 | 第28-30页 |
| 4.7 p53~(-/-)和p53~(+/+) HCT116细胞裸鼠成瘤及PDT处理后裸鼠生存期的比较 | 第30-31页 |
| 5.讨论 | 第31-33页 |
| 6.小结 | 第33-34页 |
| 第二章 p53调控miR-124 及miR-124 与PDT杀伤结肠癌细胞的研究 | 第34-60页 |
| 1.前言 | 第34-35页 |
| 2.实验材料 | 第35-38页 |
| 2.1 细胞和质粒 | 第35页 |
| 2.2 主要仪器、器材 | 第35-37页 |
| 2.3 主要试剂 | 第37页 |
| 2.4 组织标本 | 第37-38页 |
| 3.实验方法 | 第38-50页 |
| 3.1 实时荧光定量QPCR | 第38-40页 |
| 3.1.1 实验前准备 | 第38页 |
| 3.1.2 引物设计与合成 | 第38页 |
| 3.1.3 RNA的提取及检测 | 第38-39页 |
| 3.1.4 逆转录 | 第39-40页 |
| 3.1.5 实时荧光定量PCR反应 | 第40页 |
| 3.2 载体构建 | 第40-48页 |
| 3.2.1 引物设计及模板序列获取 | 第40-42页 |
| 3.2.2 目的片段的扩增 | 第42-43页 |
| 3.2.3 目的片段酶切 | 第43-44页 |
| 3.2.4 目的片段连接 | 第44页 |
| 3.2.5 质粒的转化 | 第44-45页 |
| 3.2.6 接菌与培养 | 第45页 |
| 3.2.7 质粒大提 | 第45-46页 |
| 3.2.8 质粒检测 | 第46-47页 |
| 3.2.9 质粒测序验证 | 第47页 |
| 3.2.10 酶切产物回收 | 第47页 |
| 3.2.11 普通产物纯化回收 | 第47-48页 |
| 3.2.12 常规使用溶液配制 | 第48页 |
| 3.3 细胞培养及处理 | 第48-49页 |
| 3.4 miRNA与质粒共转染细胞 | 第49页 |
| 3.5 Lucifersae检测 | 第49-50页 |
| 3.6 统计学分析 | 第50页 |
| 4.实验结果 | 第50-57页 |
| 4.1 p53~(wt)和p53~(mut)组织样品中结肠癌相关miRNA表达差异检测 | 第50-51页 |
| 4.2 p53~(wt)和p53~(mut)结肠癌细胞中miR-124 表达差异检测 | 第51-52页 |
| 4.3 p53~(-/-)和p53~(+/+) HCT116中miR-124 表达差异检测 | 第52页 |
| 4.4 miR-124 与PDT对HT29和RKO细胞活力影响 | 第52-53页 |
| 4.5 miR-124 与PDT对p53~(-/-)和p53~(+/+) HCT116细胞活力影响 | 第53-54页 |
| 4.6 miR-124 启动子报告质粒构建结果 | 第54-55页 |
| 4.7 HT29细胞中验证p53与miR-124 启动子报告质粒作用关系 | 第55-56页 |
| 4.8 HCT116细胞中验证p53与miR-124 启动子报告质粒的作用 | 第56-57页 |
| 5.讨论 | 第57-59页 |
| 6.小结 | 第59-60页 |
| 第三章 miR-124 调控iASPP及干扰iASPP与PDT杀伤结肠癌细胞的研究 | 第60-82页 |
| 1. 前言 | 第60-61页 |
| 2. 实验材料 | 第61-62页 |
| 2.1 细胞 | 第61页 |
| 2.2 主要仪器、器材 | 第61-62页 |
| 2.3 主要试剂 | 第62页 |
| 2.4 组织标本 | 第62页 |
| 3. 实验方法 | 第62-73页 |
| 3.1 细胞培养及处理 | 第62-63页 |
| 3.2 载体构建方法 | 第63页 |
| 3.3 sh-IASPP慢病毒包装 | 第63-70页 |
| 3.3.1 引物设计及退火 | 第63页 |
| 3.3.2 慢病毒载体 | 第63-65页 |
| 3.3.3 骨架质粒线性化 | 第65-66页 |
| 3.3.4 亚克隆 | 第66页 |
| 3.3.5 细胞的转染 | 第66-67页 |
| 3.3.6 病毒的收获和浓缩 | 第67-68页 |
| 3.3.7 慢病毒滴度的测定 | 第68-70页 |
| 3.4 双荧光素酶报告质粒构建 | 第70-73页 |
| 3.4.1 psi CHECK2载体图谱 | 第70-71页 |
| 3.4.2 3＇-UTR构建策略 | 第71-72页 |
| 3.4.3 miRNA与质粒共转染细胞 | 第72-73页 |
| 3.4.4 Lucifersae检测 | 第73页 |
| 3.5 统计学分析 | 第73页 |
| 4. 实验结果 | 第73-79页 |
| 4.1 组织和细胞中miR-124 与iASPP表达情况 | 第73-74页 |
| 4.2 sh-iASPP与PDT对HT29和RKO细胞活力影响 | 第74-75页 |
| 4.3 sh-iASPP与PDT对p53~(-/-)和p53~(+/+) HCT116细胞活力影响 | 第75-76页 |
| 4.4 iASPP 3＇-UTR报告质粒构建结果 | 第76-77页 |
| 4.5 293 细胞中验证miR-124 与iASPP 3＇-UTR的作用关系 | 第77-79页 |
| 5. 讨论 | 第79-81页 |
| 6. 小结 | 第81-82页 |
| 参考文献 | 第82-87页 |
| 综述 | 第87-101页 |
| 参考文献 | 第96-101页 |
| 攻读学位期间主要研究成果 | 第101-102页 |
| 致谢 | 第102页 |
