| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 第一章 综述 | 第11-19页 |
| 1 PED的流行 | 第11-13页 |
| ·国外流行情况 | 第12页 |
| ·国内流行情况 | 第12-13页 |
| 2 PEDV的形态结构 | 第13页 |
| 3 PEDV的分类地位和分子特征 | 第13-14页 |
| 4 PED的诊断 | 第14-16页 |
| ·RT-PCR法 | 第14-15页 |
| ·ELISA法 | 第15页 |
| ·免疫电镜法 | 第15页 |
| ·直接免疫荧光法 | 第15-16页 |
| ·微量血清中和试验 | 第16页 |
| 5 PED的治疗 | 第16页 |
| 6 PED的疫苗研究 | 第16-18页 |
| ·PED组织灭活苗 | 第16-17页 |
| ·PED细胞灭活苗 | 第17页 |
| ·PED弱毒苗 | 第17页 |
| ·转基因疫苗 | 第17-18页 |
| ·植物疫苗 | 第17页 |
| ·乳酸杆菌疫苗 | 第17-18页 |
| 7 选题的目的及意义 | 第18-19页 |
| 第二章 一株PEDV流行毒株全基因组的序列分析 | 第19-38页 |
| 1 材料与方法 | 第19-24页 |
| ·样品 | 第19页 |
| ·主要试剂 | 第19页 |
| ·主要仪器设备 | 第19页 |
| ·引物设计 | 第19-20页 |
| ·总RNA提取 | 第20页 |
| ·获得目的片段的方法 | 第20页 |
| ·PEDV全基因的分析 | 第20-21页 |
| ·参考序列 | 第21页 |
| ·RT-PCR | 第21-22页 |
| ·RT-PCR扩增体系 | 第21页 |
| ·RT-PCR扩增程序 | 第21-22页 |
| ·PCR产物鉴定及纯化回收 | 第22页 |
| ·PCR产物鉴定 | 第22页 |
| ·PCR产物的回收 | 第22页 |
| ·PCR产物连接与转化 | 第22-23页 |
| ·连接 | 第22页 |
| ·转化 | 第22-23页 |
| ·重组质粒提取、鉴定及序列测定 | 第23-24页 |
| ·筛选菌落 | 第23页 |
| ·碱裂解法提取质粒 | 第23页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第23-24页 |
| ·序列测定 | 第24页 |
| 2 结果 | 第24-35页 |
| ·RT-PCR扩增结果 | 第24页 |
| ·PEDV流行毒株SDZB_CH2014与64株参考毒株系统发育关系 | 第24-26页 |
| ·S基因分析 | 第26-29页 |
| ·S基因抗原性分析 | 第26页 |
| ·S基因的B细胞线性表位分析 | 第26-28页 |
| ·S基因的系统发育树 | 第28-29页 |
| ·ORF3系统发育关系树 | 第29-31页 |
| ·E基因系统发育关系树 | 第31页 |
| ·M基因系统发育关系树 | 第31-34页 |
| ·N基因系统发育关系树 | 第34-35页 |
| 3 讨论 | 第35-38页 |
| 第三章 2013-2014年PEDV地方流行毒株S基因的分析 | 第38-47页 |
| 1 材料与方法 | 第38-40页 |
| ·样品 | 第38页 |
| ·主要试剂 | 第38页 |
| ·主要仪器设备 | 第38页 |
| ·引物设计 | 第38-39页 |
| ·总RNA提取 | 第39页 |
| ·获得目的片段的方法 | 第39页 |
| ·S 基因的分析 | 第39页 |
| ·参考序列 | 第39-40页 |
| ·PEDV S基因RT-PCR | 第40页 |
| ·RT-PCR扩增体系 | 第40页 |
| ·RT-PCR扩增程序 | 第40页 |
| ·PCR产物鉴定及纯化回收 | 第40页 |
| ·PCR产物连接与转化 | 第40页 |
| ·重组质粒提取、鉴定及序列测定 | 第40页 |
| 2. 结果与分析 | 第40-45页 |
| ·S基因的RT-CR | 第40-41页 |
| ·PEDV流行毒株S基因与参考毒株的系统发育关系树 | 第41-45页 |
| ·序列确定 | 第41页 |
| ·PEDV S基因的系统发育树 | 第41-44页 |
| ·PEDV S基因与8株参考毒株同源性分析 | 第44-45页 |
| 3 讨论 | 第45-47页 |
| 第四章 PEDV流行毒株和疫苗株S基因抗原表位表达 | 第47-58页 |
| 1 材料和方法 | 第47-53页 |
| ·病毒、细胞、载体、感受态细胞 | 第47页 |
| ·主要试剂 | 第47页 |
| ·主要仪器设备 | 第47页 |
| ·融合试剂盒的选择 | 第47页 |
| ·引物的设计 | 第47-48页 |
| ·大肠杆菌原核表达载体和限制性内切酶的选择 | 第48页 |
| ·目的片段扩增引物和融合片段(S1P1-3)的鉴定引物 | 第48-49页 |
| ·目的片段扩增 | 第49页 |
| ·目的片段的融合和转化 | 第49-50页 |
| ·PCR产物电泳、回收 | 第49-50页 |
| ·目的片段的融合 | 第50页 |
| ·融合片段的转化 | 第50页 |
| ·重组质粒提取和鉴定 | 第50页 |
| ·筛选菌落 | 第50页 |
| ·碱裂解法提取质粒 | 第50页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第50页 |
| ·大肠杆菌原核表达载体pET32a(+)和含有融合片段的重组质粒PMD18-T的酶切、回收 | 第50页 |
| ·酶切 | 第50页 |
| ·回收 | 第50页 |
| ·表达载体pET32a(+)与融合片段S1P1-3的连接 | 第50页 |
| ·重组表达载体转入DH5 α感受态细胞 | 第50页 |
| ·重组表达载体转入原核表达菌BL21 | 第50-51页 |
| ·鉴定 | 第51页 |
| ·表达 | 第51-52页 |
| ·时间优化 | 第51页 |
| ·IPTG浓度优化 | 第51-52页 |
| ·SDS-PAGE | 第52页 |
| ·Western BLot | 第52-53页 |
| ·电泳分离 | 第52页 |
| ·转膜 | 第52-53页 |
| ·杂交与显色 | 第53页 |
| 2 结果和分析 | 第53-57页 |
| ·S1基因3个片段的PCR扩增 | 第53-54页 |
| ·载体和融合片段的酶切 | 第54-55页 |
| ·重组质粒PCR鉴定 | 第55页 |
| ·SDS-PAGE | 第55-56页 |
| ·Western-Blotting检测 | 第56-57页 |
| 3 讨论 | 第57-58页 |
| 第五章 结论 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-63页 |
| 攻读硕士期间的主要科研成果 | 第63-64页 |
| 项目资助 | 第64-65页 |
| 致谢 | 第65-66页 |
| 附录 | 第66页 |
