| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 目录 | 第8-12页 |
| 第一章 前言 | 第12-23页 |
| 1 BVDV病原学基础 | 第12-16页 |
| ·BVDV病毒蛋白及生物学功能 | 第12-13页 |
| ·BVDV的致病机制 | 第13-14页 |
| ·BVDV的免疫逃逸机制 | 第14-16页 |
| 2 RNA干扰(RNAi)技术的研究进展 | 第16-21页 |
| ·RNAi的发生机制 | 第17页 |
| ·哺乳动物细胞中的RNAi | 第17-18页 |
| ·哺乳动物细胞中稳定表达的RNAi | 第18-19页 |
| ·RNAi的限制性 | 第19-20页 |
| ·RNAi的非特异性和脱靶效应 | 第20页 |
| ·针对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)RNAi的研究进展 | 第20-21页 |
| ·RNAi在动物疾病治疗中的前景 | 第21页 |
| 3 本课题研究的意义 | 第21-23页 |
| 第二章 shRNA干扰RNAi载体的设计及鉴定 | 第23-36页 |
| ·材料 | 第23-26页 |
| ·质粒和菌株 | 第23-24页 |
| ·工具酶和主要试剂 | 第24页 |
| ·主要试剂的配制 | 第24-26页 |
| ·主要仪器 | 第26页 |
| ·方法 | 第26-32页 |
| ·靶向BVDV的shRNA寡核苷酸链的设计与合成 | 第26-27页 |
| ·shRNA模板寡核苷酸退火 | 第27页 |
| ·pSGHl载体质粒的提取和线性化 | 第27-29页 |
| ·连接shRNA模板寡核苷酸链和线性化的载体pSGH1 | 第29页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌DH5α | 第29-30页 |
| ·阳性菌落的挑取与培养 | 第30页 |
| ·阳性单克隆的鉴定 | 第30-32页 |
| ·阳性单克隆质粒的提取 | 第32页 |
| ·结果 | 第32-35页 |
| ·靶向BVDV的重组shRNA表达载体PCR鉴定 | 第32-33页 |
| ·靶向BVDV的重组shRNA表达载体双酶切鉴定 | 第33-34页 |
| ·靶向BVDV的重组shRNA表达载体测序法鉴定 | 第34-35页 |
| ·讨论 | 第35-36页 |
| 第三章 稳定表达shRNA的细胞系建立 | 第36-45页 |
| ·实验材料 | 第36-38页 |
| ·细胞 | 第36页 |
| ·试剂 | 第36页 |
| ·主要试剂的配制 | 第36-37页 |
| ·主要仪器 | 第37-38页 |
| ·方法 | 第38-41页 |
| ·MDBK细胞的培养 | 第38页 |
| ·G418筛选浓度的摸索 | 第38-39页 |
| ·质粒的线性化 | 第39页 |
| ·线性化质粒载体的纯化 | 第39页 |
| ·线性化的重组载体稳定转染MDBK细胞 | 第39-40页 |
| ·联用eGFP标记和Neomycin抗性标记筛选细胞克隆 | 第40页 |
| ·稳定转染细胞克隆的挑选 | 第40-41页 |
| ·阴性对照细胞的设置 | 第41页 |
| ·结果 | 第41-44页 |
| ·G418细胞筛选浓度的确定 | 第41-42页 |
| ·稳定转染干扰载体细胞的筛选 | 第42-43页 |
| ·稳定表达干扰载体单克隆细胞系的建立 | 第43-44页 |
| ·讨论 | 第44-45页 |
| 第四章 稳定表达shRNA的细胞系对BVDV复制的抑制效果 | 第45-58页 |
| ·实验材料 | 第45-46页 |
| ·细胞 | 第45页 |
| ·病毒和抗体 | 第45页 |
| ·主要试剂及配制 | 第45-46页 |
| ·方法 | 第46-52页 |
| ·BVDV病毒的培养与收集 | 第46页 |
| ·BVDV感染稳定表达shRNA单克隆细胞系的致细胞病变效应(CPE) | 第46-47页 |
| ·BVDV感染稳定表达shRNA单克隆细胞系中的TCID50 | 第47页 |
| ·RT-PCR检测BVDV E2基因的表达 | 第47-51页 |
| ·流式细胞术检测稳定表达shRNA细胞系的结合 | 第51-52页 |
| ·结果 | 第52-56页 |
| ·BVDV感染shRNA单克隆细胞系的CPE | 第52页 |
| ·BVDV感染shRNA单克隆细胞系的TCID50 | 第52-53页 |
| ·RT-PCR检测稳定表达shRNA单克隆细胞系对BVDV复制的抑制效果 | 第53-54页 |
| ·流式细胞术检测shRNA对BVDV结合细胞的的抑制效果 | 第54-56页 |
| ·讨论 | 第56-58页 |
| 第五章 全文总结 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-64页 |
| 致谢 | 第64-65页 |
| 附录：英文缩略词表 | 第65-66页 |
| 作者简历 | 第66页 |
| 学习经历 | 第66页 |
| 科研经历 | 第66页 |
| 所获奖励 | 第66页 |
| 硕士在读期间撰写和已发表的论文 | 第66页 |
