| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 1 引言 | 第12-28页 |
| ·醇脱氢酶的研究现状 | 第12-21页 |
| ·ADH 的分子结构 | 第12-13页 |
| ·ADH 的酶促反应作用机理 | 第13-15页 |
| ·人类ADH 的基因多态性 | 第15-17页 |
| ·不同来源的ADH 的基本研究 | 第17-19页 |
| ·ADH 的应用 | 第19-21页 |
| ·基因定点突变技术的研究进展 | 第21-27页 |
| ·基因定点突变技术的主要特征 | 第21页 |
| ·寡核苷酸引物指导的定点诱变 | 第21-24页 |
| ·盒式诱变 | 第24页 |
| ·PCR 介导的定点诱变 | 第24-27页 |
| ·研究目的与意义 | 第27-28页 |
| 2 材料 | 第28-30页 |
| ·实验材料 | 第28页 |
| ·克隆和表达载体 | 第28页 |
| ·酶和生化试剂 | 第28页 |
| ·引物 | 第28-29页 |
| ·主要仪器和设备 | 第29-30页 |
| 3 方法 | 第30-39页 |
| ·人醇脱氢酶ADH2 的定点突变 | 第30-34页 |
| ·对人醇脱氢酶ADH2 质粒进行双酶切鉴定 | 第30页 |
| ·ADH2 点突变第一轮PCR 反应 | 第30页 |
| ·第一轮PCR 产物的纯化 | 第30-31页 |
| ·ADH2 点突变第二轮PCR 反应 | 第31页 |
| ·突变ADH2 PCR 产物的纯化 | 第31-32页 |
| ·PCR 纯化产物与克隆载体的连接 | 第32页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第32页 |
| ·重组克隆载体的转化 | 第32-33页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第33页 |
| ·阳性重组质粒的鉴定 | 第33页 |
| ·定点突变后的ADH2 基因cDNA 序列测定与结果分析 | 第33-34页 |
| ·突变ADH2 基因全长CDNA 在大肠杆菌中的表达 | 第34-35页 |
| ·带有相匹配粘性末端ADH2 基因全长cDNA 与原核载体的制备 | 第34页 |
| ·ADH2 基因成熟多肽cDNA 与原核表达载体的连接 | 第34页 |
| ·重组原核表达载体的转化 | 第34页 |
| ·阳性重组质粒的筛选与鉴定 | 第34-35页 |
| ·阳性重组质粒转化表达宿主菌及鉴定 | 第35页 |
| ·重组质粒的诱导 | 第35页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE 分析 | 第35页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第35-39页 |
| ·Chitin 纯化柱的平衡 | 第35-36页 |
| ·包涵体的溶解 | 第36页 |
| ·融合蛋白的复性 | 第36页 |
| ·纯化目的蛋白 | 第36页 |
| ·Chitin 树脂的再生与保存 | 第36-37页 |
| ·纯化蛋白质含量的测定 | 第37页 |
| ·突变ADH2 重组酶活力检测 | 第37-39页 |
| 4 实验结果 | 第39-46页 |
| ·对人醇脱氢酶ADH2 的定点突变 | 第39-41页 |
| ·对人醇脱氢酶ADH2 质粒进行双酶切鉴定 | 第39页 |
| ·对ADH2 进行定点突变的第一轮PCR 反应 | 第39-40页 |
| ·对ADH2 进行定点突变的第二轮PCR 反应 | 第40页 |
| ·突变重组克隆质粒pGEM-T-ADH2 的鉴定 | 第40页 |
| ·突变ADH2 基因cDNA 序列测定与结果分析 | 第40-41页 |
| ·ADH2 突变基因全长CDNA 在大肠杆菌中的表达 | 第41-44页 |
| ·ADH2 突变基因全长cDNA 原核表达载体的构建 | 第41-42页 |
| ·ADH2 突变基因全长cDNA 在大肠杆菌中的表达 | 第42-44页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第44-46页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第44页 |
| ·纯化重组酶的蛋白质浓度 | 第44-45页 |
| ·重组酶活性检测 | 第45-46页 |
| 5 讨论 | 第46-53页 |
| ·ADH2 空间结构分析 | 第46-48页 |
| ·定点突变方法的选择 | 第48-49页 |
| ·目的蛋白的高效表达 | 第49-50页 |
| ·包涵体的溶解及融合蛋白的复性 | 第50-51页 |
| ·重组酶的酶学研究及应用前景 | 第51-53页 |
| 6 结论 | 第53-54页 |
| 致谢 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-61页 |
| 附录 | 第61-67页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第67页 |
