| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-12页 |
| 1 前言 | 第12-40页 |
| ·果胶和果胶酶 | 第12-18页 |
| ·果胶类物质 | 第12-13页 |
| ·果胶酶 | 第13-15页 |
| ·果胶酶的应用 | 第15-16页 |
| ·国内外研究概况 | 第16-18页 |
| ·TAIL-PCR 研究进展 | 第18-24页 |
| ·TAIL-PCR 技术的原理和方法 | 第19-21页 |
| ·引物设计 | 第21页 |
| ·反应条件（各成分组成） | 第21-22页 |
| ·TAIL-PCR 技术优缺点 | 第22-23页 |
| ·研究现状及应用前景 | 第23-24页 |
| ·大肠杆菌表达系统 | 第24-31页 |
| ·启动子的使用 | 第24-25页 |
| ·密码子的使用 | 第25-27页 |
| ·增强子的使用 | 第27页 |
| ·转录终止子 | 第27-28页 |
| ·mRNA 的一级与二级结构的影响 | 第28页 |
| ·蛋白酶的影响 | 第28-29页 |
| ·表达活性 | 第29页 |
| ·分泌型表达 | 第29-30页 |
| ·简化实验步骤、提高实验的可操纵性 | 第30页 |
| ·成本问题 | 第30-31页 |
| ·甲醇毕赤氏酵母P.PASTORIS 表达系统研究进展 | 第31-36页 |
| ·P.pastoris 的生物学特性 | 第31-32页 |
| ·P.pastoris 的遗传学特性 | 第32页 |
| ·P.pastoris 的甲醇代谢途径 | 第32-33页 |
| ·密码子偏爱性 | 第33页 |
| ·重组蛋白的翻译后修饰——糖基化 | 第33-34页 |
| ·分泌方式的选择 | 第34-35页 |
| ·影响表达产物活性的因素 | 第35-36页 |
| ·本论文研究的背景及意义 | 第36-37页 |
| ·技术路线 | 第37-38页 |
| ·载体构建示意图 | 第38-40页 |
| ·pET-28a(+)/pelC 表达载体构建示意图 | 第38-39页 |
| ·pPIC9K/pelC 表达载体构建示意图 | 第39-40页 |
| 2 材料和方法 | 第40-59页 |
| ·材料 | 第40-41页 |
| ·菌株 | 第40页 |
| ·主要仪器设备 | 第40页 |
| ·试剂 | 第40-41页 |
| ·方法 | 第41-47页 |
| ·培养基成分与配制 | 第41页 |
| ·试剂的配制 | 第41-42页 |
| ·细菌的培养 | 第42页 |
| ·细菌总DNA 的提取 | 第42-43页 |
| ·目的片段的回收及纯化 | 第43-44页 |
| ·产物的连接、转化 | 第44-45页 |
| ·SDS 碱裂解法制备质粒DNA | 第45-46页 |
| ·菌液或质粒为模板进行PCR 检测 | 第46-47页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第47页 |
| ·基因克隆 | 第47-54页 |
| ·引物设计、合成 | 第47-49页 |
| ·基因的扩增与克隆 | 第49-53页 |
| ·克隆载体的构建及鉴定(黄培堂等, 2002; 颜子颖等,1998) | 第53-54页 |
| ·原核表达载体的构建及鉴定 | 第54-56页 |
| ·Pectate lyase（pelC）基因编码框的制备 | 第54页 |
| ·PCR 检测 | 第54页 |
| ·酶切检测 | 第54-55页 |
| ·表达载体pET-28a(+)的制备 | 第55-56页 |
| ·真核表达载体的构建及鉴定 | 第56-59页 |
| ·pelC 基因编码框的制备 | 第56-57页 |
| ·PCR 检测 | 第57页 |
| ·酶切检测 | 第57页 |
| ·表达载体pPIC9K 的制备 | 第57-59页 |
| 3 结果与分析 | 第59-73页 |
| ·细菌总DNA 的提取 | 第59页 |
| ·中间目的片段的PCR 扩增及克隆 | 第59-61页 |
| ·中间目的片段的获得 | 第59-60页 |
| ·转化克隆的菌落PCR 鉴定与酶切鉴定 | 第60页 |
| ·果胶酶基因片段的克隆及同源性比较分析 | 第60-61页 |
| ·中间片段5’侧翼序列的扩增、克隆,鉴定及测序 | 第61-64页 |
| ·5’侧翼序列的扩增 | 第61-62页 |
| ·转化克隆的菌落PCR 鉴定与酶切鉴定 | 第62-63页 |
| ·基因片段的测序 | 第63-64页 |
| ·基因中间片段3’侧翼序列扩增、克隆、鉴定及测序 | 第64-66页 |
| ·PCR 扩增 | 第64页 |
| ·转化克隆的菌落PCR 鉴定与酶切鉴定 | 第64-65页 |
| ·基因片段的测序 | 第65-66页 |
| ·基因全长的拼接与扩增、克隆、鉴定及测序 | 第66-70页 |
| ·全长序列的扩增 | 第67页 |
| ·转化克隆的菌落PCR 鉴定与酶切鉴定 | 第67-68页 |
| ·基因片段的测序 | 第68-70页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第70-72页 |
| ·pelC 片段的制备 | 第70-71页 |
| ·pET-28a(+)空白载体线性化 | 第71页 |
| ·转化大肠杆菌DH5α | 第71-72页 |
| ·真核表达载体的构建 | 第72-73页 |
| ·pelC 片段的制备 | 第72页 |
| ·pPIC9K 空白载体线性化 | 第72-73页 |
| ·转化大肠杆菌DH5α | 第73页 |
| 4 讨论 | 第73-76页 |
| ·基因组DNA 提取问题 | 第73页 |
| ·PECTATE LYASE 基因的获得 | 第73-75页 |
| ·PECTATE LYASE 基因的序列分析 | 第75页 |
| ·表达载体的选用 | 第75-76页 |
| ·原核表达载体的选用 | 第75-76页 |
| ·真核表达载体的选用 | 第76页 |
| 5 结论 | 第76-78页 |
| 参考文献 | 第78-84页 |
| 致谢 | 第84页 |
