| 目录 | 第1-11页 |
| 摘要 | 第11-13页 |
| ABSTRACT | 第13-16页 |
| 缩略词(ABBREVIATION) | 第16-17页 |
| 第1章 文献综述 | 第17-48页 |
| 1．1 细胞因子简介 | 第17页 |
| 1．2 白细胞介素介绍 | 第17-20页 |
| 1．2．1 来源 | 第18页 |
| 1．2．2 结构特征 | 第18页 |
| 1．2．3 生物学功能 | 第18-19页 |
| 1．2．4 临床应用 | 第19-20页 |
| 1．2．4．1 疫苗佐剂应用 | 第19页 |
| 1．2．4．2 治疗药物应用 | 第19-20页 |
| 1．2．4．3 白细胞介素拮抗剂应用 | 第20页 |
| 1．2．4．4 疾病诊断指标 | 第20页 |
| 1．3 白细胞介素2的研究进展 | 第20-28页 |
| 1．3．1 IL-2的结构特点 | 第20-22页 |
| 1．3．2 IL-2的来源 | 第22页 |
| 1．3．3 IL-2受体(IL-2R)研究 | 第22-23页 |
| 1．3．4 IL-2的作用机理 | 第23-24页 |
| 1．3．5 IL-2的生物学活性 | 第24-25页 |
| 1．3．5．1 诱导T淋巴细胞增殖与分化 | 第24页 |
| 1．3．5．2 刺激活化的B细胞增殖与分化 | 第24页 |
| 1．3．5．3 诱导NK、LAK细胞增殖 | 第24页 |
| 1．3．5．4 促进细胞分泌细胞因子 | 第24页 |
| 1．3．5．5 增敏反应 | 第24-25页 |
| 1．3．6 IL-2的临床应用 | 第25-27页 |
| 1．3．6．1 免疫治疗剂 | 第25-26页 |
| 1．3．6．1．1 单独应用IL-2 | 第25页 |
| 1．3．6．1．2 IL-2与其他细胞因子或化学药物联用 | 第25-26页 |
| 1．3．6．1．3 IL-2激发LAK或TIL细胞，进行过继免疫疗法 | 第26页 |
| 1．3．6．1．4 毒副作用 | 第26页 |
| 1．3．6．2 免疫增强剂功能 | 第26页 |
| 1．3．6．3 IL-2临床检测 | 第26-27页 |
| 1．3．7 IL-2基因工程研究 | 第27-28页 |
| 1．3．7．1 IL-2的重组表达 | 第27页 |
| 1．3．7．2 IL-2生物学活性检测 | 第27-28页 |
| 1．4 白细胞介素6的研究进展 | 第28-33页 |
| 1．4．1 IL-6的结构特点 | 第28-29页 |
| 1．4．2 IL-6的来源 | 第29页 |
| 1．4．3 IL-6受体(IL-6R)研究 | 第29-30页 |
| 1．4．4 IL-6的作用机理 | 第30页 |
| 1．4．5 IL-6的生物学活性 | 第30-32页 |
| 1．4．5．1 IL-6对B细胞的活性 | 第30-31页 |
| 1．4．5．2 IL-6对T细胞的影响 | 第31页 |
| 1．4．5．3 IL-6对造血细胞的作用 | 第31页 |
| 1．4．5．4 IL-6对肝细胞的活性 | 第31页 |
| 1．4．5．5 IL-6对神经细胞的活性 | 第31页 |
| 1．4．5．6 IL-6对肿瘤细胞的活性 | 第31-32页 |
| 1．4．6 IL-6的临床作用 | 第32-33页 |
| 1．4．6．1 IL-6对机体保护性作用 | 第32页 |
| 1．4．6．2 IL-6对机体杀伤性作用 | 第32-33页 |
| 1．4．7 IL-6的基因工程研究 | 第33页 |
| 1．4．7．1 IL-6的重组表达 | 第33页 |
| 1．4．7．2 IL-6生物学活性检测 | 第33页 |
| 1．5 IL-2与IL-6在免疫作用中的相互关系 | 第33-34页 |
| 1．6 佐剂简述 | 第34-40页 |
| 1．6．1 盐类佐剂 | 第34-35页 |
| 1．6．2 油乳佐剂 | 第35页 |
| 1．6．3 脂质体 | 第35页 |
| 1．6．4 微生物及微生物来源的佐剂 | 第35-36页 |
| 1．6．5 植物来源的佐剂 | 第36-37页 |
| 1．6．6 细胞因子佐剂 | 第37-40页 |
| 1．6．6．1 细胞因子蛋白佐剂研究 | 第37-38页 |
| 1．6．6．2 细胞因子基因佐剂研究 | 第38-39页 |
| 1．6．6．3 新型细胞因子重组基因工程疫苗 | 第39-40页 |
| 1．7 重组蛋白表达系统简述 | 第40-43页 |
| 1．7．1 大肠杆菌表达体系 | 第40-41页 |
| 1．7．2 酵母表达体系 | 第41页 |
| 1．7．3 昆虫细胞表达体系 | 第41-42页 |
| 1．7．4 哺乳动物细胞表达系统 | 第42-43页 |
| 1．8 PRV简述 | 第43-45页 |
| 1．8．1 PRV简介 | 第43-44页 |
| 1．8．2 PRV危害 | 第44页 |
| 1．8．3 PRV疫苗 | 第44-45页 |
| 1．9 PRRSV简述 | 第45-48页 |
| 1．9．1 PRRSV简介 | 第45-46页 |
| 1．9．2 PRRSV危害 | 第46页 |
| 1．9．3 PRRSV疫苗 | 第46-48页 |
| 第2章 研究目的与意义 | 第48-49页 |
| 第3章 材料与方法 | 第49-73页 |
| 3．1 实验材料 | 第49-58页 |
| 3．1．1 质粒与菌株 | 第49页 |
| 3．1．2 细胞、毒株与疫苗 | 第49-54页 |
| 3．1．3 实验动物 | 第54页 |
| 3．1．4 生化试剂 | 第54页 |
| 3．1．5 主要培养基 | 第54-56页 |
| 3．1．5．1 大肠杆菌培养基 | 第54页 |
| 3．1．5．2 酵母培养基 | 第54-55页 |
| 3．1．5．2．1 贮存液 | 第54-55页 |
| 3．1．5．2．2 酵母培养基 | 第55页 |
| 3．1．5．3 哺乳动物细胞培养基及消化液 | 第55-56页 |
| 3．1．6 缓冲液 | 第56-57页 |
| 3．1．6．1 质粒提取用缓冲液 | 第56页 |
| 3．1．6．1．1 重组质粒快速检验裂解液 | 第56页 |
| 3．1．6．1．2 标准碱裂解提取质粒缓冲液 | 第56页 |
| 3．1．6．2 SDS-PAGE缓冲液及染液 | 第56-57页 |
| 3．1．6．2．1 SDS-PAGE缓冲液 | 第56页 |
| 3．1．6．2．2 考马斯亮蓝染液 | 第56页 |
| 3．1．6．2．3 银染相关溶液、 | 第56-57页 |
| 3．1．6．3 Western blot缓冲液 | 第57页 |
| 3．1．7 E．coli感受态制备用试剂 | 第57页 |
| 3．1．8 Pichia pastoris感受态制备用试剂 | 第57页 |
| 3．1．9 ELISA缓冲液 | 第57-58页 |
| 3．1．10 其它缓冲液 | 第58页 |
| 3．2 实验方法 | 第58-73页 |
| 3．2．1 PCR扩增IL-2和IL-6 | 第58-59页 |
| 3．2．1．1 PCR扩增的引物序列 | 第58-59页 |
| 3．2．1．2 PCR反应体系 | 第59页 |
| 3．2．1．3 PCR反应条件 | 第59页 |
| 3．2．2 PCR产物的回收与纯化 | 第59页 |
| 3．2．3 PCR产物的克隆 | 第59-60页 |
| 3．2．4 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第60页 |
| 3．2．5 连接产物及质粒的转化 | 第60页 |
| 3．2．6 重组质粒的快速鉴定 | 第60-61页 |
| 3．2．6．1 PCR快速鉴定 | 第60页 |
| 3．2．6．2 快速裂解鉴定 | 第60-61页 |
| 3．2．7 质粒的制备 | 第61页 |
| 3．2．7．1 质粒的小量制备(碱裂解法) | 第61页 |
| 3．2．7．2 质粒的大量制备(碱裂解法) | 第61页 |
| 3．2．8 细胞因子原核表达 | 第61-63页 |
| 3．2．8．1 IPTG诱导表达 | 第61-62页 |
| 3．2．8．2 包涵体提取 | 第62页 |
| 3．2．8．2．1 重组菌可溶蛋白与不可溶蛋白(包涵体)的分离 | 第62页 |
| 3．2．8．2．2 包涵体的变性及复性 | 第62页 |
| 3．2．8．3 表达产物的浓度测定 | 第62页 |
| 3．2．8．4 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳 | 第62-63页 |
| 3．2．8．4．1 蛋白凝胶电泳 | 第62-63页 |
| 3．2．8．4．2 蛋白凝胶考马斯亮蓝染色 | 第63页 |
| 3．2．9 细胞因子多克隆抗体的制备 | 第63页 |
| 3．2．9．1 免疫原的制备 | 第63页 |
| 3．2．9．2 免疫程序 | 第63页 |
| 3．2．10 细胞因子酵母表达 | 第63-67页 |
| 3．2．10．1 重组质粒转化感受态毕赤酵母(LiCl法) | 第63-64页 |
| 3．2．10．1．1 质粒的准备(线性化) | 第63页 |
| 3．2．10．1．2 感受态酵母细胞制备 | 第63页 |
| 3．2．10．1．3 质粒转化毕赤酵母菌 | 第63-64页 |
| 3．2．10．2 酵母重组基因组的提取(PCR模板制备) | 第64页 |
| 3．2．10．2．1 酵母基因组的常规提取步骤 | 第64页 |
| 3．2．10．2．2 快速制备酵母质粒和基因组方法 | 第64页 |
| 3．2．10．2．3 简便制备酵母基因组方法 | 第64页 |
| 3．2．10．3 酵母阳性重组子筛选(PCR) | 第64-65页 |
| 3．2．10．3．1 PCR检测的引物序列 | 第64页 |
| 3．2．10．3．2 PCR反应体系 | 第64-65页 |
| 3．2．10．3．3 PCR反应程序 | 第65页 |
| 3．2．10．4 重组酵母菌的诱导表达 | 第65页 |
| 3．2．10．5 银染 | 第65页 |
| 3．2．10．6 表达产物的Western blot检测 | 第65-66页 |
| 3．2．10．6．1 电转 | 第65-66页 |
| 3．2．10．6．2 染色 | 第66页 |
| 3．2．10．6．3 封闭 | 第66页 |
| 3．2．10．6．4 第一抗体和靶蛋白结合 | 第66页 |
| 3．2．10．6．5 二级抗体与硝酸纤维素滤膜的温育 | 第66页 |
| 3．2．10．6．6 加入底物显色 | 第66页 |
| 3．2．10．7 表达产物的N-联糖基化分析 | 第66页 |
| 3．2．10．8 重组菌株最佳表达时间的测定 | 第66页 |
| 3．2．10．9 不同批次重组菌株的表达情况检测 | 第66-67页 |
| 3．2．10．10 酵母表达产物的浓缩与纯化 | 第67页 |
| 3．2．10．11 酵母菌株的保存 | 第67页 |
| 3．2．11 重组蛋白稳定性检测 | 第67页 |
| 3．2．12 细胞因子真核表达 | 第67-68页 |
| 3．2．12．1 质粒转染哺乳细胞 | 第67页 |
| 3．2．12．2 G418抗性筛选 | 第67-68页 |
| 3．2．13 重组细胞因子生物学活性的测定 | 第68-69页 |
| 3．2．13．1 用CTLL-2细胞检测IL-2生物学活性 | 第68-69页 |
| 3．2．13．1．1 CTLL-2细胞的培养，冻存，复苏条件 | 第68页 |
| 3．2．13．1．2 IL-2生物学活性测定 | 第68-69页 |
| 3．2．13．2 用B9细胞检测IL-6生物学活性 | 第69页 |
| 3．2．13．2．1 B9细胞的培养 | 第69页 |
| 3．2．13．2．2 IL-6生物学活性测定 | 第69页 |
| 3．2．14 动物试验 | 第69-70页 |
| 3．2．14．1 重组细胞因子蛋白的免前准备 | 第69页 |
| 3．2．14．2 重组细胞因子蛋白对灭活苗佐剂效应猪试验免疫程序 | 第69-70页 |
| 3．2．14．3 细胞因子基因对核酸疫苗佐剂效应小鼠试验程序 | 第70页 |
| 3．2．15 病毒TCID_(50)的测定 | 第70页 |
| 3．2．16 病毒微量中和试验(固定病毒-稀释血清法) | 第70页 |
| 3．2．17 ELISA检测 | 第70-71页 |
| 3．2．18 CTL检测 | 第71-72页 |
| 3．2．18．1 外周血单核细胞(PBMC)的分离 | 第71页 |
| 3．2．18．2 靶细胞的制备 | 第71页 |
| 3．2．18．3 乳酸脱氢酶(LDH)分析检测CTL效应 | 第71-72页 |
| 3．2．19 攻毒后PCR检测试验猪散毒情况 | 第72页 |
| 3．2．19．1 鼻拭子处理 | 第72页 |
| 3．2．19．2 PCR检测的引物序列 | 第72页 |
| 3．2．19．3 PCR反应体系 | 第72页 |
| 3．2．19．4 PCR反应程序 | 第72页 |
| 3．2．20 统计方法 | 第72-73页 |
| 第4章 结果与分析 | 第73-104页 |
| 4．1 pIL-2，pIL-6和pIL6-IL2的原核表达 | 第73-79页 |
| 4．1．1 pIL-2的原核表达 | 第73-74页 |
| 4．1．1．1 表达质粒pET-IL2的构建 | 第73页 |
| 4．1．1．2 rpIL-2的原核表达及包涵体提取 | 第73-74页 |
| 4．1．2 pIL-6的原核表达 | 第74-76页 |
| 4．1．2．1 PCR扩增去除信号肽的pIL-6序列 | 第74页 |
| 4．1．2．2 中间转移质粒SK~+-IL6的构建 | 第74页 |
| 4．1．2．3 表达质粒pGEX-IL6的构建 | 第74-75页 |
| 4．1．2．4 rpIL6的原核表达及包涵体提取 | 第75-76页 |
| 4．1．3 pIL6-IL2的原核表达 | 第76-79页 |
| 4．1．3．1 PCR扩增 | 第76页 |
| 4．1．3．2 表达质粒28a-IL6-IL2的构建 | 第76-78页 |
| 4．1．3．3 rpIL6-IL2的原核表达及包涵体提取 | 第78-79页 |
| 4．2 pIL-2，pIL-6和pIL6-IL2的毕赤酵母表达 | 第79-93页 |
| 4．2．1 pIL-2的毕赤酵母表达 | 第79-83页 |
| 4．2．1．1 表达质粒pPIC3．5K-IL2的构建 | 第79页 |
| 4．2．1．2 pPIC3．5K-IL2重组入酵母染色体的PCR鉴定 | 第79-80页 |
| 4．2．1．3 rpIL-2的酵母表达及Western blot分析 | 第80-81页 |
| 4．2．1．4 酵母表达产物rpIL-2的去N端糖基化分析 | 第81-82页 |
| 4．2．1．5 重组酵母菌GS115/pPIC3．5K-IL2表达情况分析 | 第82-83页 |
| 4．2．1．6 酵母表达产物rpIL-2的生物学活性鉴定 | 第83页 |
| 4．2．2 pIL-6的毕赤酵母表达 | 第83-87页 |
| 4．2．2．1 表达质粒pPIC9K-IL6的构建 | 第83-84页 |
| 4．2．2．2 pPIC9K-IL6重组入酵母染色体的PCR鉴定 | 第84页 |
| 4．2．2．3 rpIL-6的酵母表达及Western blot分析 | 第84-85页 |
| 4．2．2．4 酵母表达产物rpIL6的去N端糖基化分析 | 第85-86页 |
| 4．2．2．5 rpIL-6蛋白的浓缩与纯化 | 第86页 |
| 4．2．2．6 酵母表达产物rpIL-6的生物学活性鉴定 | 第86-87页 |
| 4．2．3 pIL6-IL2的毕赤酵母表达 | 第87-93页 |
| 4．2．3．1 表达质粒pPIC9K-IL6-IL2构建 | 第87-88页 |
| 4．2．3．2 pPIC9K-IL6-IL2重组入酵母染色体的PCR鉴定 | 第88页 |
| 4．2．3．3 rpIL6-IL2的酵母表达 | 第88页 |
| 4．2．3．4 酵母表达产物rpIL6-IL2的去N端糖基化分析 | 第88-90页 |
| 4．2．3．5 重组酵母菌GS115/pPIC9K-IL6-IL2表达情况分析 | 第90页 |
| 4．2．3．6 酵母表达产物rpIL6-IL2的Western blot分析 | 第90-91页 |
| 4．2．3．7 酵母表达产物rPIL6-IL2的生物学活性鉴定 | 第91-93页 |
| 4．2．4 原核表达产物与酵母表达产物的生物学活性比较 | 第93页 |
| 4．3 表达产物稳定性检测 | 第93-94页 |
| 4．4 pIL-2，pIL-6和pIL6-IL2的真核表达 | 第94-97页 |
| 4．4．1 含PRRSV ORF5基因及不同细胞因子基因的真核表达载体构建 | 第94-95页 |
| 4．4．2 细胞因子在Hela细胞中的表达 | 第95-97页 |
| 4．5 重组细胞因子蛋白对PRV灭活疫苗的佐剂效应研究 | 第97-101页 |
| 4．5．1 中和抗体水平检测 | 第97-98页 |
| 4．5．2 CTL水平检测 | 第98页 |
| 4．5．3 攻毒保护试验结果 | 第98-101页 |
| 4．5．3．1 临床症状 | 第98-99页 |
| 4．5．3．2 体温变化 | 第99页 |
| 4．5．3．3 排毒情况 | 第99-101页 |
| 4．6 细胞因子基因对PRRSV ORF5核酸疫苗的佐剂效应研究 | 第101-104页 |
| 4．6．1 中和抗体水平检测 | 第101-102页 |
| 4．6．2 ELISA检测 | 第102-104页 |
| 第5章 讨论与结论 | 第104-115页 |
| 5．1 pIL-2的表达 | 第104-106页 |
| 5．1．1 pIL-2在E．Coli中的表达及纯化 | 第104-105页 |
| 5．1．2 pIL-2在P．pastoris中的表达 | 第105-106页 |
| 5．2 pIL-6的表达 | 第106-107页 |
| 5．2．1 pIL-6在E．Coli中的表达及纯化 | 第106页 |
| 5．2．2 pIL-6在P．pastoris中的表达及纯化 | 第106-107页 |
| 5．3 pIL6-IL2的表达 | 第107-108页 |
| 5．3．1 融合蛋白pIL6-IL2的设计 | 第107-108页 |
| 5．3．2 融合蛋白pIL6-IL2在E．coli与P．pastoris中的表达 | 第108页 |
| 5．4 细胞因子重组蛋白对PRV灭活苗的佐剂效应研究 | 第108-112页 |
| 5．4．1 重组蛋白rpIL-2对PRV灭活苗免疫效力影响 | 第109-110页 |
| 5．4．2 重组蛋白rpIL-6对PRV灭活苗免疫效力影响 | 第110-111页 |
| 5．4．3 重组蛋白rpIL6-IL2对PRV灭活苗免疫效力影响 | 第111-112页 |
| 5．5 细胞因子基因对PRRSV ORF5核酸疫苗的佐剂效应研究 | 第112-113页 |
| 5．5．1 联有细胞因子基因的PRRSV ORF5核酸疫苗构建 | 第112-113页 |
| 5．5．2 细胞因子基因对PRRSV ORF5核酸疫苗的佐剂效应 | 第113页 |
| 5．6 结论 | 第113-115页 |
| 参考文献 | 第115-130页 |
| 致谢 | 第130-131页 |
| 附录 | 第131-132页 |
