| 致谢 | 第3-4页 |
| 博士学位论文自评表 | 第4-5页 |
| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第一章 绪论 | 第11-28页 |
| 1.1 植物内生菌与病害的关系 | 第11-15页 |
| 1.1.1 非松属植物内生菌与病害的关系 | 第11-12页 |
| 1.1.2 松属植物内生菌与松材线虫病的关系 | 第12-15页 |
| 1.2 松属体外菌与松材线虫病关系 | 第15-17页 |
| 1.2.1 松材线虫伴生细菌与松材线虫病关系 | 第15-17页 |
| 1.2.2 松材线虫伴生真菌与松材线虫病关系 | 第17页 |
| 1.3 微生物菌群结构对病原侵染响应研究 | 第17-19页 |
| 1.3.1 人体及动物微生物菌群结构对病原侵染的响应研究 | 第17-18页 |
| 1.3.2 植物微生物菌群结构对病原侵染的响应研究 | 第18-19页 |
| 1.4 微生物菌群多样性的研究方法 | 第19-22页 |
| 1.4.1 平板分离培养法及Biolog微量分析方法 | 第19页 |
| 1.4.2 16SrDNA文库构建技术及T-RFLP技术 | 第19-20页 |
| 1.4.3 PCR-SSCP技术及高通量测序技术 | 第20-21页 |
| 1.4.4 磷脂脂肪酸(PLFA)技术及荧光原位杂交(FISH) | 第21页 |
| 1.4.5 ERIC-PCR图谱分析及PCR-DGGE分析技术 | 第21-22页 |
| 1.5 微生物指纹图谱DGGE技术在微生物多样性中的应用 | 第22-24页 |
| 1.5.1 DGGE技术在工业环境微生物研究中的应用 | 第22-23页 |
| 1.5.2 DGGE技术对动植物微生物群落结构及功能的应用 | 第23-24页 |
| 1.6 苏云金芽孢杆菌Bt杀线工程菌的研究进展 | 第24-25页 |
| 1.6.1 苏云金芽孢杆菌及其杀虫(线虫)伴孢晶体蛋白 | 第24页 |
| 1.6.2 Bt蛋白对植物线虫的毒杀作用 | 第24-25页 |
| 1.6.3 Bt蛋白与重组生防菌的研究 | 第25页 |
| 1.7 B.pyrrociniaJK-SH007内生菌的生防作用 | 第25-26页 |
| 1.8 本研究目的和意义 | 第26-28页 |
| 第二章 马尾松体内菌对松材线虫侵染响应 | 第28-47页 |
| 2.1 材料与方法 | 第28-29页 |
| 2.1.1 样地选择及菌株、接种体 | 第28-29页 |
| 2.1.2 药品和试剂 | 第29页 |
| 2.1.3 仪器设备 | 第29页 |
| 2.2 研究方法 | 第29-35页 |
| 2.2.1 培养基与试剂准备 | 第29-31页 |
| 2.2.2 样品的采集、材料准备及预处理 | 第31页 |
| 2.2.3 基因组总DNA的提取和检测 | 第31-32页 |
| 2.2.4 PCR扩增 | 第32-33页 |
| 2.2.5 DGGE变性梯度胶制备 | 第33页 |
| 2.2.6 DGGE目标条带的割胶回收和序列分析 | 第33页 |
| 2.2.7 Takara感受态细胞制作试剂盒制备感受态细胞 | 第33-34页 |
| 2.2.8 DNA片段T克隆及阳性克隆筛选与测序鉴定 | 第34页 |
| 2.2.9 图像处理与数据分析 | 第34-35页 |
| 2.3 结果与分析 | 第35-44页 |
| 2.3.1 马尾松样品体内菌及割胶回收菌基因组PCR验证 | 第35页 |
| 2.3.2 不同胸径健康马尾松样品(J1-J10)菌群结构分析 | 第35-36页 |
| 2.3.3 机械损伤对马尾松体内菌群结构的影响 | 第36-38页 |
| 2.3.4 松材线虫侵染对马尾松体内菌群结构的影响 | 第38-39页 |
| 2.3.5 马尾松体内菌群对松材线虫侵染的一致性响应规律 | 第39页 |
| 2.3.6 松材线虫病早期诊断模式图构建与验证 | 第39页 |
| 2.3.7 松材线虫侵染正负相关体内菌株的鉴定与分析 | 第39-44页 |
| 2.4 讨论 | 第44-45页 |
| 2.5 小结 | 第45-47页 |
| 第三章 Cry218杀虫基因JK-SH007表达载体的构建及其杀虫活性研究 | 第47-58页 |
| 3.1 材料与方法 | 第47-50页 |
| 3.1.1 菌株与质粒 | 第47-48页 |
| 3.1.2 培养基与试剂 | 第48页 |
| 3.1.3 杀虫基因PCR扩增及表达载体构建 | 第48页 |
| 3.1.4 PCR产物割胶回收、纯化连接及遗传转化 | 第48-49页 |
| 3.1.5 吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007高效感受态细胞制备 | 第49页 |
| 3.1.6 吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007感受态细胞电激转化 | 第49页 |
| 3.1.7 重组子菌落PCR以及质粒凝胶电泳验证 | 第49页 |
| 3.1.8 杀虫蛋白的SDS-PAGE、western blot及质谱分析 | 第49-50页 |
| 3.1.9 工程菌株杀虫生物活性检测及统计分析 | 第50页 |
| 3.2 结果与分析 | 第50-55页 |
| 3.2.1 PCR扩增目的蛋白基因Cry218及反向PCR线性化表达载体pHKT2 | 第50页 |
| 3.2.2 表达载体Cry218-pHKT2质粒抽提及质粒模板PCR鉴定 | 第50-51页 |
| 3.2.3 杀虫蛋白的SDS-PAGE分析 | 第51-52页 |
| 3.2.4 Cry218在吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007中表达优化 | 第52-53页 |
| 3.2.5 工程菌株Cry218-pHKT2杀虫生物活性检测 | 第53-54页 |
| 3.2.6 工程菌株Cry218-pHKT2杀松材线虫生物活性检测 | 第54-55页 |
| 3.3 讨论 | 第55-56页 |
| 3.4 小结 | 第56-58页 |
| 第四章 Cry3A杀虫蛋白基因在JK-SH007中高效表达 | 第58-71页 |
| 4.1 材料与方法 | 第58-63页 |
| 4.1.1 菌株、质粒、培养基与试剂 | 第58-59页 |
| 4.1.2 Cry3Aa的人工合成及优化 | 第59-62页 |
| 4.1.3 重组质粒构建 | 第62-63页 |
| 4.1.4 Cry3Aa基因在吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007中的表达 | 第63页 |
| 4.1.5 SDS-PAGE、westernblot及质谱分析 | 第63页 |
| 4.1.6 生物毒杀活性 | 第63页 |
| 4.2 结果与分析 | 第63-68页 |
| 4.2.1 Cry3Aa基因合成与优化 | 第63-64页 |
| 4.2.2 构建Cry3A蛋白表达载体pHKT2-Cry3Aa | 第64-65页 |
| 4.2.3 Cry3A杀虫蛋白在B.pyrrociniastrainJK-SH007中的表达 | 第65-66页 |
| 4.2.4 吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007中Cry3Aa杀虫蛋白生物活性评价 | 第66-67页 |
| 4.2.5 工程菌株Cry3Aa-pHKT2杀松材线虫生物活性检测 | 第67-68页 |
| 4.3 讨论 | 第68-70页 |
| 4.4 小结 | 第70-71页 |
| 第五章 总结和展望 | 第71-73页 |
| 5.1 总结 | 第71-72页 |
| 5.2 展望 | 第72-73页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-87页 |
| 附录 DNA 序列 | 第87-88页 |
