| 个人简历 | 第3-10页 |
| 摘要 | 第10-12页 |
| ABSTRACT | 第12-14页 |
| 第一章: 前言 | 第15-16页 |
| 第二章: 过表达重组慢病毒LV-HPV58E6E7融合基因对宫颈癌细胞部分生物学特性的体外研究 | 第16-72页 |
| 第一节 过表达重组慢病毒LV-HPV58E6E7融合基因对人宫颈癌C33A细胞部分生物学特性的体外研究 | 第16-61页 |
| 1. 材料和方法 | 第17-51页 |
| 1.1 材料 | 第17-24页 |
| 1.1.1 质粒、菌株、细胞 | 第17-20页 |
| 1.1.2 主要试剂 | 第20-21页 |
| 1.1.3 实验主要仪器设备 | 第21-22页 |
| 1.1.4 部分试剂的配制 | 第22-24页 |
| 1.1.5 用具处理 | 第24页 |
| 1.2 方法 | 第24-51页 |
| 1.2.1 GV303慢病毒表达系统的构建 | 第24-33页 |
| 1.2.1.1 HPV58E6E7融合基因PCR扩增所需引物设计及合成 | 第24页 |
| 1.2.1.2 HPV58E6E7融合基因片段PCR扩增 | 第24-27页 |
| 1.2.1.3 HPV58E6E7融合基因PCR扩增产物的纯化及回收 | 第27-28页 |
| 1.2.1.4 AgeI/ NheI双酶切GV303载体 | 第28-29页 |
| 1.2.1.5 PCR纯化产物交换入GV303线性化表达载体 | 第29页 |
| 1.2.1.6 连接产物转化大肠杆菌DH-5 α感受态细胞 | 第29-30页 |
| 1.2.1.7 挑取阳性克隆 | 第30-31页 |
| 1.2.1.8 重组慢病毒表达质粒的初步鉴定 | 第31页 |
| 1.2.1.9 质粒DNA快速提取 | 第31-32页 |
| 1.2.1.10 重组慢病毒表达质粒的PCR鉴定 | 第32页 |
| 1.2.1.11 重组慢病毒表达质粒测序 | 第32-33页 |
| 1.2.2 慢病毒颗粒包装及其滴度测定 | 第33页 |
| 1.2.3 病毒颗粒感染人宫颈癌细胞 | 第33-35页 |
| 1.2.3.1 细胞培养、传代、冻存及计数 | 第33-34页 |
| 1.2.3.2 病毒颗粒感染C33A细胞 | 第34-35页 |
| 1.2.3.3 转染效率的检测 | 第35页 |
| 1.2.4 三组细胞培养 | 第35-36页 |
| 1.2.5 Trizol法提取三组细胞总RNA | 第36页 |
| 1.2.6 浓度及纯度检测 | 第36-37页 |
| 1.2.7 cDNA合成 | 第37-38页 |
| 1.2.8 pMD18-T/GAPDH、pMD18-T/HPV58 E6E7融合基因质粒的构建 | 第38-41页 |
| 1.2.8.1 引物设计、合成及稀释 | 第38页 |
| 1.2.8.2 GAPDH基因扩增(RT-PCR) | 第38-39页 |
| 1.2.8.3 GAPDH产物的纯化与回收 | 第39页 |
| 1.2.8.4 回收纯化的GAPDH基因片段与pMD18-T载体连接 | 第39-40页 |
| 1.2.8.5 pMD18-T/GAPDH、pMD18-T/HPV58 E6E7融合基因质粒转化DH-5 α感受态细胞 | 第40页 |
| 1.2.8.6 阳性克隆的挑选 | 第40-41页 |
| 1.2.8.7 pMD18-T/GAPDH、pMD18-T/HPV58 E6E7融合基因质粒的初步鉴定 | 第41页 |
| 1.2.8.8 大量提取pMD18-T/GAPDH、pMD18-T/HPV58 E6E7融合基因质粒 | 第41页 |
| 1.2.8.9 pMD18-T/GAPDH、pMD18-T/HPV58 E6E7融合基因质粒的PCR鉴定 | 第41页 |
| 1.2.9 制备pMD18-T/GAPDH、pMD18-T/HPV58 E6E7融合基因质粒标准品 | 第41-42页 |
| 1.2.10 慢病毒介导C33A细胞中HPV58E6E7融合基因的表达情况 | 第42-46页 |
| 1.2.10.1 实时荧光定量PCR(QRT-PCR)检测三组细胞中HPV58E6E7融合基因的含量 | 第42-45页 |
| 1.2.10.2 结果计算方法 | 第45页 |
| 1.2.10.3 统计学分析 | 第45-46页 |
| 1.2.11 慢病毒介导C33A细胞中His-tag标签蛋白的表达情况 | 第46-51页 |
| 1.2.11.1 单层贴壁细胞总蛋白的提取 | 第46页 |
| 1.2.11.2 BCA法各组蛋白浓度测定 | 第46-47页 |
| 1.2.11.3 Western Blot检测三组细胞中His-tag标签蛋白的含量 | 第47-51页 |
| 2. 实验结果 | 第51-60页 |
| 2.1 HPV58E6E7融合基因的特异性扩增 | 第51页 |
| 2.2 重组质粒HPV58E6E7融合基因-GV303 RT-PCR电泳结果 | 第51-52页 |
| 2.3 重组质粒HPV58E6E7融合基因-GV303测序结果 | 第52-53页 |
| 2.4 重组质粒HPV58E6E7融合基因-GV303转染293T细胞结果(此部分委托上海吉凯基因化学技术有限公司完成) | 第53-54页 |
| 2.5 病毒滴度测定结果(此部分委托上海吉凯基因化学技术有限公司完成) | 第54-55页 |
| 2.6 病毒颗粒感染人宫颈癌C33A细胞 | 第55页 |
| 2.7 转染效率检测 | 第55-57页 |
| 2.8 pMD18-T/GAPDH、pMD18-T/HPV58 E6E7重组质粒单克隆结果 | 第57页 |
| 2.9 pMD18-T/GAPDH、pMD18-T/HPV58 E6E7融合基因质粒RT-PCR鉴定 | 第57-58页 |
| 2.10 pMD18-T/GAPDH、pMD18-T/HPV58 E6E7融合基因质粒扩增标准曲线结果 | 第58页 |
| 2.11 荧光定量PCR检测三组细胞中HPV58E6E7融合基因的病毒负载量 | 第58-59页 |
| 2.12 Western Blot验证三组细胞中HIS-tag标签蛋白的表达 | 第59-60页 |
| 小结 | 第60-61页 |
| 第二节 过表达重组慢病毒LV-HPV58E6E7融合基因转染对C33A细胞生长及其周期的影响 | 第61-72页 |
| 1. 材料和方法 | 第61-64页 |
| 1.1 材料 | 第61-62页 |
| 1.1.1 细胞株 | 第61页 |
| 1.1.2 试剂及配置 | 第61页 |
| 1.1.3 主要实验仪器 | 第61-62页 |
| 1.2 方法 | 第62-64页 |
| 1.2.1 MTT法检测三组细胞生长曲线的测定 | 第62-63页 |
| 1.2.2 流式细胞仪检测三组细胞生长周期变化 | 第63-64页 |
| 2. 结果 | 第64-66页 |
| 2.1 MTT法测定三组细胞生长曲线 | 第64页 |
| 2.2 流式细胞仪检测各组细胞周期的变化 | 第64-66页 |
| 小结 | 第66-67页 |
| 本章讨论 | 第67-72页 |
| 第三章: 稳定表达HPV58E6E7融合基因的C33A细胞株在裸鼠体内真核表达的鉴定 | 第72-82页 |
| 1、材料和方法 | 第72-76页 |
| 1.1 实验动物、细胞及仪器 | 第72-73页 |
| 1.2 裸鼠皮下成瘤模型的建立 | 第73-74页 |
| 1.2.1 细胞培养及裸鼠左腋下皮肤接种 | 第73页 |
| 1.2.2 观察裸鼠皮下成瘤情况 | 第73页 |
| 1.2.3 小动物活体成像仪了解裸鼠皮下种植瘤体中荧光表达情况 | 第73页 |
| 1.2.4 种植瘤取出并保存 | 第73-74页 |
| 1.3 裸鼠皮下瘤组织中HPV58E6E7融合基因的表达情况 | 第74-76页 |
| 1.3.1 荧光定量PCR检测三组瘤组织中HPV58-E6E7融合基因的含量 | 第74-75页 |
| 1.3.2 Western Blot检测三组裸鼠皮下瘤组织中HIS标签蛋白的表达 | 第75-76页 |
| 2、结果 | 第76-79页 |
| 2.1 成功建立裸鼠皮下成瘤模型 | 第76页 |
| 2.2 荧光定量PCR检测三组瘤组织中HPV58E6E7的表达 | 第76-77页 |
| 2.3 Western Blot验证三组瘤组织中His-tag标签蛋白的表达 | 第77-79页 |
| 3、本章讨论 | 第79-82页 |
| 全文小结 | 第82-83页 |
| 正文参考文献 | 第83-88页 |
| 附录 | 第88-89页 |
| 第四章: 宫颈癌HPV感染及其疫苗研究现状(文献综述) | 第89-121页 |
| 1、目前宫颈癌现状 | 第89-91页 |
| 2、宫颈癌发病的高危因素 | 第91-95页 |
| 2.1 生物学因素 | 第91-93页 |
| 2.1.1 病毒感染 | 第91-92页 |
| 2.1.2 宫颈慢性疾病 | 第92-93页 |
| 2.2 性行为与生殖相关因素 | 第93-94页 |
| 2.2.1 初次性生活过早 | 第93页 |
| 2.2.2 性生活紊乱 | 第93-94页 |
| 2.2.3 多孕多产 | 第94页 |
| 2.3 雌激素水平 | 第94页 |
| 2.4 遗传因素 | 第94-95页 |
| 2.5 其他 | 第95页 |
| 3、HPV分子结构及其生物学特性 | 第95-96页 |
| 4、HPV的分型及其流行病学分布情况 | 第96-97页 |
| 4.1 HPV分型 | 第96页 |
| 4.2 HPV流行病学情况 | 第96-97页 |
| 5、HPV的致病机制 | 第97-101页 |
| 5.1 HPV DNA的整合 | 第97-98页 |
| 5.2 HPV与细胞周期的关系 | 第98-99页 |
| 5.3 HPV与细胞凋亡的关系 | 第99-100页 |
| 5.4 HPV与机体免疫的关系 | 第100-101页 |
| 5.4.1 细胞免疫 | 第100页 |
| 5.4.2 体液免疫 | 第100-101页 |
| 6、HPV58型感染与宫颈癌的关系 | 第101-102页 |
| 6.1 HPV58的结构 | 第101页 |
| 6.2 HPV58的致癌机理 | 第101-102页 |
| 7、HPV疫苗的研究进展 | 第102-109页 |
| 7.1 HPV疫苗的研究背景 | 第102页 |
| 7.2 HPV疫苗的分型及其临床试验成果 | 第102-109页 |
| 7.2.1 HPV预防性疫苗 | 第102-104页 |
| 7.2.2 HPV治疗性疫苗 | 第104-109页 |
| 综述参考文献 | 第109-121页 |
| 致谢 | 第121页 |
