| 致谢 | 第4-8页 |
| 摘要 | 第8-9页 |
| 1 文献综述 | 第9-16页 |
| 1.1 简介 | 第9-10页 |
| 1.1.1 猪流行性腹泻病简介 | 第9页 |
| 1.1.2 临床症状 | 第9页 |
| 1.1.3 发病原因 | 第9页 |
| 1.1.4 病理变化 | 第9-10页 |
| 1.1.5 诊断方法 | 第10页 |
| 1.2 PEDV的基因组结构与复制 | 第10-11页 |
| 1.2.1 PEDV基因组结构 | 第10页 |
| 1.2.2 PEDV基因组复制 | 第10-11页 |
| 1.3 PEDV基因组编码的蛋白及其功能 | 第11-12页 |
| 1.3.1 非结构蛋白及其功能 | 第11页 |
| 1.3.2 结构蛋白及其功能 | 第11-12页 |
| 1.4 PEDV表面抗原蛋白表达与纯化方面的研究 | 第12-13页 |
| 1.5 PEDV疫苗的研究进展和发展前景 | 第13-14页 |
| 1.5.1 传统疫苗 | 第13页 |
| 1.5.2 基因工程疫苗 | 第13-14页 |
| 1.5.3 联苗 | 第14页 |
| 1.5.4 发展前景 | 第14页 |
| 1.6 本实验研究的目的与意义 | 第14-16页 |
| 2 引言 | 第16-17页 |
| 3 材料 | 第17-19页 |
| 3.1 仪器设备 | 第17页 |
| 3.2 病料、菌种、质粒 | 第17页 |
| 3.3 主要试剂 | 第17页 |
| 3.4 部分试剂与培养基的配置 | 第17-19页 |
| 4 方法 | 第19-29页 |
| 4.1 引物的设计 | 第19页 |
| 4.2 病毒RNA的提取 | 第19页 |
| 4.3 RT-PCR | 第19-20页 |
| 4.4 PCR产物回收 | 第20页 |
| 4.5 连接 | 第20-21页 |
| 4.6 连接产物的转化 | 第21-23页 |
| 4.6.1 JM109感受态细胞的制备 | 第21页 |
| 4.6.2 转化 | 第21页 |
| 4.6.3 PMD19-T-COE连接载体的鉴定 | 第21-23页 |
| 4.6.3.1 PCR鉴定 | 第21-22页 |
| 4.6.3.2 双酶切鉴定 | 第22-23页 |
| 4.6.3.3 PMD19-T-COE质粒的测序 | 第23页 |
| 4.7 表达载体的构建 | 第23-24页 |
| 4.7.1 分别对质粒PMD19-T-COE和原核表达载体PET-32a进行双酶切 | 第23页 |
| 4.7.2 重组质粒PET-32a-COE转化到BL21(DE3)p Lys S细胞及鉴定 | 第23-24页 |
| 4.8 HIS-COE蛋白的表达及鉴定 | 第24-27页 |
| 4.8.1 诱导表达 | 第24页 |
| 4.8.2 SDS-PAGE | 第24-25页 |
| 4.8.2.1 菌液样品的处理 | 第24-25页 |
| 4.8.2.2 灌制蛋白胶 | 第25页 |
| 4.8.2.3 考马斯亮蓝染色 | 第25页 |
| 4.8.3 蛋白质表达条件的优化 | 第25-27页 |
| 4.8.3.1 IPTG浓度的优化 | 第25-26页 |
| 4.8.3.2 诱导时间的优化 | 第26页 |
| 4.8.3.3 表达蛋白可溶性鉴定 | 第26-27页 |
| 4.9 包涵体的纯化与复性 | 第27-29页 |
| 4.9.1 样品的制备 | 第27页 |
| 4.9.2 样品预处理 | 第27页 |
| 4.9.3 柱子的制备 | 第27页 |
| 4.9.4 透析袋的处理 | 第27页 |
| 4.9.5 过柱纯化 | 第27-28页 |
| 4.9.6 复性 | 第28页 |
| 4.9.7 western blot | 第28-29页 |
| 4.9.7.1 电泳与转膜 | 第28页 |
| 4.9.7.2 封闭和一抗的孵育 | 第28页 |
| 4.9.7.3 二抗的孵育和显影 | 第28-29页 |
| 5 结果与分析 | 第29-40页 |
| 5.1 COE基因扩增 | 第29页 |
| 5.2 重组质粒PMD19-T-COE的鉴定与分析 | 第29-31页 |
| 5.2.1 菌液PCR鉴定 | 第29-30页 |
| 5.2.2 重组质粒PMD19-T-COE的双酶切鉴定 | 第30-31页 |
| 5.2.3 重组质粒PMD19-T-COE的鉴定结果分析 | 第31页 |
| 5.3 COE基因测序结果与分析 | 第31-33页 |
| 5.3.1 COE基因测序结果 | 第31-33页 |
| 5.3.2 PEDV-COE基因测序比对结果分析 | 第33页 |
| 5.4 重组质粒PET-32A-COE的鉴定与分析 | 第33-35页 |
| 5.4.1 菌液PCR鉴定 | 第33-34页 |
| 5.4.2 双酶切鉴定重组质粒PET-32a-COE | 第34-35页 |
| 5.4.3 重组质粒PET-32a-COE的鉴定结果分析 | 第35页 |
| 5.5 SDS-PAGE鉴定结果与分析 | 第35-39页 |
| 5.5.1 重组菌BL21(DE3)p Lys S/PET-32a-COE的SDS-PAGE | 第35-36页 |
| 5.5.2 重组蛋白HIS-COE诱导条件的优化 | 第36-37页 |
| 5.5.2.1 诱导时间的优化 | 第36-37页 |
| 5.5.2.2 IPTG浓度诱导优化 | 第37页 |
| 5.5.3 重组蛋白HIS-COE可溶性分析 | 第37-38页 |
| 5.5.4 HIS-COE蛋白的纯化 | 第38页 |
| 5.5.5 SDS-PAGE鉴定结果分析 | 第38-39页 |
| 5.6 HIS-COE蛋白WESTERN BLOT结果与分析 | 第39-40页 |
| 5.6.1 HIS-COE蛋白western blot结果 | 第39页 |
| 5.6.2 HIS-COE蛋白western blot结果的分析 | 第39-40页 |
| 6 结论与讨论 | 第40-41页 |
| 参考文献 | 第41-47页 |
| 英文摘要 | 第47-48页 |
