| 摘要 | 第5-6页 |
| abstract | 第6页 |
| 第一章 绪论 | 第11-17页 |
| 1.1 课题研究背景 | 第11-16页 |
| 1.1.1 玻连蛋白分子的研究和应用现状 | 第11-15页 |
| 1.1.2 用CHO和HEK293T细胞表达重组蛋白的研究现状 | 第15-16页 |
| 1.2 研究内容和意义 | 第16-17页 |
| 1.2.1 玻连蛋白分子的克隆和纯化 | 第16页 |
| 1.2.2 本研究的意义 | 第16-17页 |
| 第二章 细胞的培养和转染 | 第17-29页 |
| 2.1 前言 | 第17页 |
| 2.2 实验材料 | 第17-18页 |
| 2.2.1 实验仪器和设备 | 第17页 |
| 2.2.2 实验试剂和耗材 | 第17-18页 |
| 2.3 实验方法和步骤 | 第18-23页 |
| 2.3.1 CHO K1细胞的培养、驯化和冻存 | 第18-20页 |
| 2.3.1.1 CHO K1细胞的复苏 | 第18-20页 |
| 2.3.1.2 CHO K1细胞的传代与降血清及悬浮驯化 | 第20页 |
| 2.3.1.3 CHO K1细胞的冻存 | 第20页 |
| 2.3.2 293T细胞的培养和传代 | 第20-21页 |
| 2.3.2.1 293T细胞的复苏 | 第20-21页 |
| 2.3.2.2 293T细胞的传代 | 第21页 |
| 2.3.2.3 293T细胞的冻存 | 第21页 |
| 2.3.3 FreeStyle~TM CHO-S细胞的培养和传代 | 第21页 |
| 2.3.4 293T细胞的转染 | 第21-22页 |
| 2.3.5 CHO K1细胞的转染 | 第22页 |
| 2.3.6 Freestyle CHO-S细胞的转染 | 第22-23页 |
| 2.3.7 CHO-K1-S的转染 | 第23页 |
| 2.4 实验结果 | 第23-24页 |
| 2.4.1 CHO K1的驯化结果及其与293T细胞的培养条件探究 | 第23-24页 |
| 2.4.2 转染实验结果 | 第24页 |
| 2.5 本章小结与展望 | 第24-29页 |
| 第三章 重组质粒的构建 | 第29-51页 |
| 3.1 前言 | 第29-30页 |
| 3.2 实验材料 | 第30-31页 |
| 3.2.1 实验仪器和设备 | 第30-31页 |
| 3.2.2 实验试剂 | 第31页 |
| 3.3 实验方法和步骤 | 第31-44页 |
| 3.3.1 人cDNA文库的构建 | 第31-34页 |
| 3.3.1.1 外周血单核细胞的获取 | 第31-32页 |
| 3.3.1.2 总RNA的提取 | 第32-33页 |
| 3.3.1.3 人cDNA文库的构建 | 第33-34页 |
| 3.3.2 玻连蛋白cDNA分子的克隆 | 第34-36页 |
| 3.3.3 酶切位点的引入与重组质粒pEXL-FTH-VTN的构建 | 第36-41页 |
| 3.3.3.1 酶切位点的引入 | 第36-37页 |
| 3.3.3.2 目的基因(VTN)与pEXL-FTH-GFP的双酶切 | 第37-39页 |
| 3.3.3.3 目的基因与pEXL-FTH-GFP酶切产物的连接 | 第39-40页 |
| 3.3.3.4 转化 | 第40页 |
| 3.3.3.5 重组子的挑选和鉴定 | 第40-41页 |
| 3.3.3.6 基因序列的鉴定和筛选 | 第41页 |
| 3.3.4 碱基定点突变及其结果检测 | 第41-43页 |
| 3.3.4.1 定点突变PCR | 第42页 |
| 3.3.4.2 电泳检测 | 第42页 |
| 3.3.4.3 PCR产物的消化 | 第42页 |
| 3.3.4.4 转化 | 第42-43页 |
| 3.3.4.5 定点突变质粒的鉴定 | 第43页 |
| 3.3.5 第二次碱基定点突变及结果检测 | 第43页 |
| 3.3.6 带His-tag标签引物的设计及pEXL-FTH-VTN-His重组质粒的构建 | 第43-44页 |
| 3.3.7 pcDNA3.1-VTN-YFP-his重组载体的构建 | 第44页 |
| 3.3.8 pET-28a-VTN-his重组质粒的构建 | 第44页 |
| 3.4 实验结果 | 第44-49页 |
| 3.4.1 玻连蛋白cDNA克隆结果 | 第44-46页 |
| 3.4.2 pEXL-FTH-VTN重组质粒的构建结果 | 第46-47页 |
| 3.4.3 两次定点突变结果 | 第47页 |
| 3.4.4 his-tag重组质粒的构建结果 | 第47-49页 |
| 3.5 本章小结与讨论 | 第49-51页 |
| 第四章 玻连蛋白的表达和纯化 | 第51-65页 |
| 4.1 前言 | 第51-52页 |
| 4.2 实验材料 | 第52页 |
| 4.2.1 实验仪器和设备 | 第52页 |
| 4.2.2 实验试剂和耗材 | 第52页 |
| 4.3 实验方法和步骤 | 第52-57页 |
| 4.3.1 重组质粒转染293T细胞 | 第52页 |
| 4.3.2 镍柱纯化 | 第52-55页 |
| 4.3.3 SDS-PAGE考马斯亮蓝染色法检测表达效果 | 第55页 |
| 4.3.4 玻连蛋白的纯化及浓度检测 | 第55-56页 |
| 4.3.5 BL21(DE3)表达玻连蛋白的实验探究及结果检测 | 第56页 |
| 4.3.6 WesternBlot检测表达的目的蛋白 | 第56-57页 |
| 4.3.6.1 SDS-PAGE | 第56页 |
| 4.3.6.2 转膜 | 第56-57页 |
| 4.3.6.3 免疫反应 | 第57页 |
| 4.3.6.4 化学显影及拍摄 | 第57页 |
| 4.3.7 表达蛋白的生物学功能验证 | 第57页 |
| 4.4 实验结果 | 第57-61页 |
| 4.4.1 重组质粒转染293T细胞后SDS-PAGE实验结果 | 第57-59页 |
| 4.4.2 VTN含量测定 | 第59页 |
| 4.4.3 细菌表达结果 | 第59-60页 |
| 4.4.4 westernblot实验结果 | 第60-61页 |
| 4.4.5 重组玻连蛋白分子的生物学功能验证 | 第61页 |
| 4.5 本章小结与讨论 | 第61-65页 |
| 第五章 总结与展望 | 第65-66页 |
| 致谢 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-73页 |
| 附录一本实验用到的一些试剂的配制方法 | 第73-76页 |
| 攻硕期间与学位论文相关的研究成果 | 第76页 |
