| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 英文缩略词表 | 第9-17页 |
| 第一部分 文献综述 | 第17-29页 |
| 1. PDCoV的研究进展 | 第17-24页 |
| 1.1 PDCoV感染临床症状及流行情况 | 第17-18页 |
| 1.2 病毒的形态结构 | 第18页 |
| 1.3 基因组及蛋白 | 第18-21页 |
| 1.3.1 ORFla、ORFlb基因及蛋白 | 第19页 |
| 1.3.2 结构蛋白及基因 | 第19-20页 |
| 1.3.3 ORF6和ORF7及蛋白 | 第20-21页 |
| 1.4 PDCoV感染的病理特征 | 第21-22页 |
| 1.5 PDCoV的诊断与检测技术 | 第22-24页 |
| 1.5.1 病原学检测 | 第22-23页 |
| 1.5.2 免疫学方法 | 第23-24页 |
| 2. 单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb)在PDCoV中的研究进展 | 第24-28页 |
| 2.1 单克隆抗体技术概述 | 第24页 |
| 2.2 单克隆抗体在动物疫病的应用研究 | 第24-26页 |
| 2.2.1 单克隆抗体对动物传染性疾病的治疗 | 第25页 |
| 2.2.2 单克隆抗体在疾病诊断方面研究 | 第25-26页 |
| 2.2.3 单克隆抗体在抗原变异及蛋白功能方面研究 | 第26页 |
| 2.3 PDCoV单克隆抗体的研究进展 | 第26-28页 |
| 3. 本研究的目的与意义 | 第28-29页 |
| 第二部分 研究内容 | 第29-89页 |
| 第一章 PDCoV S基因的克隆及生物信息学分析 | 第29-49页 |
| 1. 材料 | 第29页 |
| 1.1 生物材料 | 第29页 |
| 1.2 细菌菌株 | 第29页 |
| 1.3 质粒与载体 | 第29页 |
| 1.4 主要试剂 | 第29页 |
| 1.5 主要仪器 | 第29页 |
| 2. 方法 | 第29-33页 |
| 2.1 引物设计 | 第29-30页 |
| 2.2 PDCoV S基因的克隆 | 第30-33页 |
| 2.2.1 PDCoV RNA的提取 | 第30页 |
| 2.2.2 PDCoV S基因RT-PCR扩增 | 第30-31页 |
| 2.2.3 PDCoV S基因的克隆 | 第31-32页 |
| 2.2.4 PDCoV S基因遗传进化分析 | 第32-33页 |
| 3. 结果 | 第33-47页 |
| 3.1 RT-PCR鉴定结果 | 第33-34页 |
| 3.2 S基因序列分析 | 第34-38页 |
| 3.3 S基因遗传进化树的构建 | 第38-41页 |
| 3.4 S蛋白特性分析 | 第41-47页 |
| 3.4.1 S蛋白的基本特性 | 第41-42页 |
| 3.4.2 S蛋白二级结构的预测 | 第42-43页 |
| 3.4.3 S蛋白疏水性的分析 | 第43-44页 |
| 3.4.4 S蛋白信号肽分析 | 第44-45页 |
| 3.4.5 S蛋白跨膜区分析 | 第45-46页 |
| 3.4.6 S蛋白的糖基化位点及抗原表位预测 | 第46-47页 |
| 4. 讨论 | 第47-48页 |
| 4.1 PDCoV S基因的序列分析 | 第47-48页 |
| 4.2 PDCoV S蛋白分子特性的分析 | 第48页 |
| 5. 小结 | 第48-49页 |
| 第二章 PDCoV的S1蛋白的原核表达与鉴定 | 第49-66页 |
| 1. 材料 | 第49页 |
| 1.1 细菌菌株 | 第49页 |
| 1.2 质粒与载体 | 第49页 |
| 1.3 主要试剂 | 第49页 |
| 1.4 主要仪器 | 第49页 |
| 2. 方法 | 第49-54页 |
| 2.1 目的基因S1区的选择、引物设计及扩增 | 第49-50页 |
| 2.2 重组质粒pET-22-S1的构建 | 第50-51页 |
| 2.3 重组表达质粒pET-22-S1的转化、筛选 | 第51页 |
| 2.4 重组表达质粒pET-22-S1的鉴定 | 第51页 |
| 2.5 重组S1蛋白表达初步鉴定 | 第51页 |
| 2.6 重组蛋白的免疫印迹分析 | 第51-52页 |
| 2.7 重组蛋白表达诱导条件的优化 | 第52-53页 |
| 2.7.1 诱导温度的优化 | 第52页 |
| 2.7.2 IPTG浓度的优化 | 第52页 |
| 2.7.3 诱导时间的优化 | 第52-53页 |
| 2.8 重组蛋白的大量诱导表达 | 第53页 |
| 2.9 重组蛋白的可溶性分析及纯化、浓缩 | 第53-54页 |
| 2.9.1 菌体的超声破碎 | 第53页 |
| 2.9.2 重组蛋白的分离纯化 | 第53-54页 |
| 2.9.3 重组蛋白的浓缩 | 第54页 |
| 3. 结果 | 第54-63页 |
| 3.1 重组质粒pET-22-S1的构建与鉴定 | 第54-55页 |
| 3.2 重组蛋白的初步表达及鉴定 | 第55-57页 |
| 3.3 重组蛋白S1原核表达诱导条件的优化 | 第57-60页 |
| 3.3.1 诱导温度的优化 | 第57-58页 |
| 3.3.2 IPTG浓度的优化 | 第58-59页 |
| 3.3.3 诱导时间的优化 | 第59-60页 |
| 3.4 重组蛋白S1的可溶性分析 | 第60-63页 |
| 3.4.1 重组蛋白的可溶性分析 | 第60-62页 |
| 3.4.2 重组蛋白的浓缩 | 第62-63页 |
| 4. 讨论 | 第63-65页 |
| 4.1 蛋白表达用目的基因的选择 | 第63-64页 |
| 4.2 重组蛋白S1的表达及优化 | 第64-65页 |
| 4.3 重组蛋白的可溶性分析及纯化 | 第65页 |
| 5. 小结 | 第65-66页 |
| 第三章 PDCoV S蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 | 第66-89页 |
| 1. 材料 | 第66页 |
| 1.1 病毒、细胞及实验动物 | 第66页 |
| 1.2 主要试剂 | 第66页 |
| 1.3 主要仪器 | 第66页 |
| 2. 方法 | 第66-73页 |
| 2.1 抗原浓度测定 | 第66-67页 |
| 2.2 BALB/c小鼠的免疫 | 第67页 |
| 2.3 间接ELISA方法的建立 | 第67-68页 |
| 2.4 临界值的确定 | 第68页 |
| 2.5 杂交瘤细胞的制备 | 第68-71页 |
| 2.5.1 BALB/c小鼠血清效价的测定 | 第68页 |
| 2.5.2 SP2/0细胞的培养 | 第68页 |
| 2.5.3 饲养层细胞的制备 | 第68-69页 |
| 2.5.4 脾细胞的制备 | 第69页 |
| 2.5.5 细胞融合 | 第69-70页 |
| 2.5.6 阳性杂交瘤细胞的筛选及亚克隆 | 第70-71页 |
| 2.5.7 阳性杂交瘤细胞的扩大培养、冻存及复苏 | 第71页 |
| 2.6 单克隆抗体的大量制备 | 第71-73页 |
| 2.6.1 BALB/c小鼠腹水的制备 | 第71页 |
| 2.6.2 单克隆抗体亚型的鉴定 | 第71-72页 |
| 2.6.3 单克隆抗体的纯化 | 第72-73页 |
| 2.7 单克隆抗体特性的鉴定 | 第73页 |
| 2.7.1 杂交瘤细胞培养液上清和纯化后单克隆抗体的ELISA效价测定 | 第73页 |
| 2.7.2 杂交瘤细胞稳定性测定 | 第73页 |
| 2.7.3 Western-Blot分析 | 第73页 |
| 2.7.4 单克隆抗体特异性分析 | 第73页 |
| 3. 结果 | 第73-86页 |
| 3.1 抗原浓度的测定 | 第73-74页 |
| 3.2 间接ELISA方法的建立 | 第74-75页 |
| 3.3 临界值的确定 | 第75-76页 |
| 3.4 杂交瘤细胞的制备 | 第76-80页 |
| 3.4.1 BALB/c小鼠血清效价的测定 | 第76页 |
| 3.4.2 SP2/0细胞的培养 | 第76-78页 |
| 3.4.3 饲养层细胞和脾细胞的制备 | 第78页 |
| 3.4.4 细胞融合及阳性杂交瘤细胞的筛选 | 第78-79页 |
| 3.4.5 阳性杂交瘤的筛选及亚克隆 | 第79-80页 |
| 3.5 单克隆抗体的大量制备 | 第80-83页 |
| 3.5.1 BALB/c小鼠腹水的制备 | 第80-81页 |
| 3.5.2 单克隆抗体亚型的测定 | 第81-82页 |
| 3.5.3 单克隆抗体的纯化 | 第82-83页 |
| 3.6 单克隆抗体特性的鉴定 | 第83-86页 |
| 3.6.1 单克隆抗体的ELISA效价测定 | 第83-84页 |
| 3.6.2 杂交瘤细胞稳定性的测定 | 第84页 |
| 3.6.3 单克隆抗体的Western-Blot分析 | 第84-86页 |
| 3.6.4 单克隆抗体特异性的测定 | 第86页 |
| 4. 讨论 | 第86-88页 |
| 4.1 抗原的选择及BALB/c小鼠的免疫 | 第86-87页 |
| 4.2 间接ELISA方法的建立 | 第87页 |
| 4.3 细胞的融合及杂交瘤细胞的筛选 | 第87页 |
| 4.4 抗S1蛋白单克隆抗体4G11的特性分析 | 第87-88页 |
| 5. 小结 | 第88-89页 |
| 结论 | 第89-90页 |
| 本研究的创新点 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-99页 |
| 致谢 | 第99-101页 |
| 附录 | 第101-106页 |
| 1. PDCoV CHN-SC2015株S基因序列 | 第101-103页 |
| 2. 主要试剂的配置 | 第103-104页 |
| 3. 载体图谱 | 第104-106页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第106页 |
