| 致谢 | 第5-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 1 文献综述 | 第15-27页 |
| 1.1 酯酶 | 第15-19页 |
| 1.1.1 酯酶的分类和来源 | 第15-16页 |
| 1.1.1.1 酯酶的分类 | 第15页 |
| 1.1.1.2 酯酶的来源 | 第15-16页 |
| 1.1.2 羧酸酯酶 | 第16-17页 |
| 1.1.2.1 羧酸酯酶的结构 | 第16页 |
| 1.1.2.2 羧酸酯酶的催化机制 | 第16-17页 |
| 1.1.3 羧酸酯酶BioH的研究现状 | 第17-18页 |
| 1.1.3.1 BioH在生物素合成途径上的作用 | 第17页 |
| 1.1.3.2 BioH研究现状 | 第17-18页 |
| 1.1.4 酯酶的有机溶剂催化活性 | 第18-19页 |
| 1.1.5 酯酶的工业化应用现状 | 第19页 |
| 1.2 手性药物的拆分 | 第19-22页 |
| 1.2.1 手性药物 | 第19-20页 |
| 1.2.2 手性药物的拆分 | 第20-22页 |
| 1.3 酶的定向进化研究 | 第22-25页 |
| 1.3.1 酶的定向进化 | 第22-23页 |
| 1.3.2 定向进化的原理 | 第23页 |
| 1.3.3 定向进化的步骤 | 第23-24页 |
| 1.3.4 定向进化中高通量筛选模型的建立 | 第24-25页 |
| 1.3.5 定向进化的现状及发展前景 | 第25页 |
| 1.4 研究的目的与意义 | 第25-27页 |
| 2 利用定向进化策略提高BioH水解活性的研究 | 第27-40页 |
| 2.1 材料与方法 | 第27-35页 |
| 2.1.1 材料 | 第27-28页 |
| 2.1.1.1 菌株和质粒 | 第27页 |
| 2.1.1.2 工具酶 | 第27页 |
| 2.1.1.3 试剂 | 第27-28页 |
| 2.1.1.4 主要设备 | 第28页 |
| 2.1.2 实验方法 | 第28-35页 |
| 2.1.2.1 琼脂糖凝胶电泳 | 第28-29页 |
| 2.1.2.2 BioH质粒及pET30a(+)质粒的提取 | 第29页 |
| 2.1.2.3 易错PCR | 第29-30页 |
| 2.1.2.4 目的基因及pET-30a(+)质粒的酶切、纯化以及连接 | 第30-31页 |
| 2.1.2.5 大肠杆菌BL21超级感受态的制备以及转化 | 第31-32页 |
| 2.1.2.6 突变体BioH酯酶的诱导表达 | 第32页 |
| 2.1.2.7 突变体酯酶水解活性的定性筛选 | 第32-33页 |
| 2.1.2.8 优良突变体的定量筛选 | 第33-35页 |
| 2.2 实验结果与分析 | 第35-39页 |
| 2.2.1 易错PCR条件的确定 | 第35-36页 |
| 2.2.2 突变体基因文库的构建 | 第36-37页 |
| 2.2.3 突变体的筛选 | 第37-39页 |
| 2.3 本章小结 | 第39-40页 |
| 3 突变体热稳定性及表达量的研究 | 第40-48页 |
| 3.1 材料与方法 | 第40-43页 |
| 3.1.1 材料 | 第40-41页 |
| 3.1.1.1 试剂 | 第40页 |
| 3.1.1.2 主要设备 | 第40-41页 |
| 3.1.2 实验方法 | 第41-43页 |
| 3.1.2.1 BioH突变体蛋白表达 | 第41页 |
| 3.1.2.2 BioH突变体蛋白表达量的测定 | 第41-43页 |
| 3.1.2.3 突变体的热稳定性检测 | 第43页 |
| 3.2 实验结果与分析 | 第43-47页 |
| 3.2.1 BioH突变体蛋白表达情况 | 第43-45页 |
| 3.2.2 突变体热稳定性的研究 | 第45-46页 |
| 3.2.3 突变体突变位点的定位 | 第46-47页 |
| 3.3 本章小结 | 第47-48页 |
| 4 野生型BioH及其突变体库对于酰化活性的测定 | 第48-59页 |
| 4.1 材料与方法 | 第48-51页 |
| 4.1.1 材料 | 第48-49页 |
| 4.1.1.1 试剂 | 第48页 |
| 4.1.1.2 主要实验设备及仪器 | 第48-49页 |
| 4.1.2 实验方法 | 第49-51页 |
| 4.1.2.1 野生型BioH对于酰胺化1-苯乙胺的活性检测 | 第49-50页 |
| 4.1.2.2 BioH突变体对于酰胺化1-苯乙醇的活性检测 | 第50-51页 |
| 4.1.2.3 BioH突变体对于酰胺化1-苯乙胺的活性检测 | 第51页 |
| 4.2 实验结果与分析 | 第51-58页 |
| 4.2.1 BioH的酰胺化反应 | 第51-55页 |
| 4.2.2 BioH的酯化反应 | 第55-56页 |
| 4.2.3 突变体对水解和酰化活性的影响 | 第56-58页 |
| 4.3 本章小结 | 第58-59页 |
| 5 定点组合突变进一步提高酶的酰化活性 | 第59-66页 |
| 5.1 材料与方法 | 第59-62页 |
| 5.1.1 材料 | 第59-60页 |
| 5.1.1.1 主要试剂 | 第59页 |
| 5.1.1.2 主要设备 | 第59-60页 |
| 5.1.2 实验方法 | 第60-62页 |
| 5.1.2.1 定点突变 | 第60-61页 |
| 5.1.2.2 定点突变体活性检测 | 第61-62页 |
| 5.2 结果与讨论 | 第62-64页 |
| 5.2.1 突变体制备 | 第62-63页 |
| 5.2.2 活性检测 | 第63-64页 |
| 5.3 本章小结 | 第64-66页 |
| 6 结论与展望 | 第66-69页 |
| 6.1 结论 | 第66-68页 |
| 6.2 展望 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-74页 |
| 附录 | 第74-77页 |
